Zey体外抗肿瘤作用研究体外培养人结肠癌细胞HCT-8,人宫颈癌细胞HeLa和Caski,人肝癌细胞HepG2,人乳腺癌细胞MCF-7和MX-1,人口腔表皮样癌细胞KB,人胃癌细胞BGC823,人前列腺癌细胞DU-145和PC-3共10种肿瘤细胞株和人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1和人正常膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1共2种正常细胞株,采用MTT法检测Zey的增殖抑制作用,并计算出半数抑制浓度IC50 (μM)。以对Zey敏感的人宫颈癌HeLa和Caski细胞为研究对象,首先以不同剂量(0、3.27、6.54、13.08、26.16和52.32 μM；0、1.64、3.27、6.54、13.08和26.16μM)的Zey分别于不同时间(12、24、36、72、96 h)处理HeLa和Caski细胞,测定其抑制肿瘤细胞增殖的时效和量效关系。Zey处理细胞24 h后,光学显微镜观察对细胞凋亡形态的影响；DAPI染色观察对细胞核凋亡形态的影响；克隆原形成试验检测对肿瘤细胞集落形成能力的影响；流式细胞术分析对肿瘤细胞周期分布的影响；明胶酶谱法检测对肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)分泌的影响。2. SILAC分析Zey对肿瘤细胞蛋白质组表达变化的影响通过体外培养Zey敏感的人宫颈癌HeLa细胞,应用SILAC培养基进行细胞培养、同位素标记,Zey干预24

h后,提蛋白,电泳,进行质谱检测。应用Gene Ontology、 Cytoscape软件和Western blot、qPCR技术分析和鉴定Zey处理前后人宫颈癌HeLa细胞中蛋白质组以及磷酸化蛋白质组表达的变化。3.Zey诱导肿瘤细胞凋亡作用研究应用透射电镜观察Zey对肿瘤细胞超微结构的影响；采用AO/EB染色检测Zey诱导肿瘤细胞凋亡的程度；应用流式细胞术通过JC-1染色检测Zey对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响；应用流式细胞术采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测Zey诱导肿瘤细胞凋亡的时期和比例；采用TUNEL原位检测凋亡法进一步检测Zey对肿瘤细胞诱导凋亡的比例；应用DCFH-DA荧光探针法检测Zey对肿瘤细胞活性氧产生的影响。4.Zey体外抗肿瘤分子机制研究使用Discovery Selleck Decitabine Studio 3.5软件包中ligand profiler模块,对PharmaDB药效团库中6000余种靶点药效团逐一进行匹配计算,对Zey进行作用靶点分析。应用Western blot技术研究①Zey对内源凋亡通路和外源凋亡通路标志性蛋白表达的影响；②Zey对Bcl-2家族蛋白表达的影响；③Zey对Caspase家族凋亡标志性蛋白表达的影响；④Zey对ERK/MAPK通路激酶磷酸化水平的影响；⑤Zey对PI3K/AKT/mTOR通路激酶磷酸化水平的影响；⑥应用小分子抑制剂确定Zey作用PI3K/AKT/mTOR信号通路及其上游RTKs的关键靶点蛋白。5.Zey体内对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤药效实验及分子机制研究采用人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植成瘤,再把裸鼠传代2代以上的瘤块,使用套管针接种于裸鼠腋部皮下,建立人宫颈癌裸鼠异体移植瘤模型。分别以7.5mg/kg,

selleck产品 15mg/kg剂量腹腔注射给药,连续14天,观察Zey对人宫颈癌移植瘤模型动物的体重、瘤体积和瘤重的影响,计算抑瘤率和T/C值；采用免疫组化和Western blot检测Zey对肿瘤组织中相关信号通路蛋白表达的影响。结果：1.Zey体外抗肿瘤作用的初步研究体外抗肿瘤实验表明,Zey对10种不同来源的恶性肿瘤细胞均具有明显的抑制活性,其IC50值范围为3.3-25.7μM,其中宫颈癌HeLa和Caski细胞对Zey较为敏感,IC50值分别为4.2和3.3μM,而对2种正常细胞WPMY1和SV-HUC-1的抑制作用显著低于肿瘤细胞,IC50值分别为81.4和98.4μM,表明其对肿瘤细胞具有很好的选择性。时效、量效实验表明Zey对HeLa和Caski细胞的抑制作用具有很好的时间-剂量依赖性。Zey干预24

h后,HeLa和Caski细胞皱缩,透光度增加,贴壁能力下降；DAPI染色可以观察到染色质固缩、细胞核碎裂、核解体等现象；克隆实验显示Zey对HeLa和Caski细胞具有较强的集落形成抑制能力；流式细胞仪检测Zey能够将HeLa和Caski细胞分别阻滞在G0/G1期和S期；明胶酶谱实验检测Zey能够抑制HeLa细胞的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的分泌。2. 无 SILAC分析Zey对肿瘤细胞蛋白质组表达变化的影响为了明确Zey抗肿瘤作用的蛋白质组变化,从而能够高效、快速地定位Zey可能的作用靶点和作用机制,应用SILAC蛋白组学技术对Zey作用前后的蛋白质组的变化进行了筛选。结果发现Zey作用HeLa细胞24 h导致229个蛋白显著改变,15个蛋白表达上调,214个蛋白表达下调,其中下调幅度较大的蛋白包括：14-3-3protein theta、14-3-3 protein zeta/delta、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL、PARP1、HSP70 1A/1B、 HSP 90-beta、HSP70-4、HSP beta-1、HSP105、HSP 90-alpha、RPL38、RPL17、RPS8、 RPL7a和RPL37a等,这些蛋白主要与细胞能量代谢、细胞凋亡和细胞周期相关。3.Zey诱导肿瘤细胞凋亡作用研究在SILAC实验结果的基础上,我们进一步考察Zey是否能够诱导细胞凋亡。通过透射电镜观察、AO/EB染色、TUNEL、JC-1检测线粒体膜电位、Annexin V-FITC双染检测细胞凋亡的时期和比例以及DCFH-DA荧光探针检测活性氧等实验,可观察到Zey干预24 h后,HeLa和Caski细胞表现出明显的凋亡形态,在超微结构下,能够观察到凋亡小体的产生,线粒体膜电位显著降低,产生大量活性氧,HeLa和Caski细胞凋亡比例最高可分别达到：83.68%和88.00%,表明Zey可明显诱导HeLa和Caski细胞的凋亡。4.Zey体外抗肿瘤分子机制研究对Zey抗肿瘤分子机制的研究发现其明显诱导肿瘤细胞凋亡,对凋亡的内源性通路和外源性通路均产生影响,可活化凋亡因子caspase-8, caspase-9, caspase-7, caspase-3以及PARP和Bid,而使FasL、Bcl-2、Bcl-xL等表达下降,FasL、Fas、FADD等表达上调,诱导线粒体内Cytochrome c和AIF释放到胞质。应用Discovery Studio 3.