s-p38蛋白)。通过生物信息学对E.s-p38蛋白的功能域、二级结构、三维结构等进行了分析。E.s-p38蛋白有一个p38 MAPK的功能域(STKc_p38),是一个典型的丝氨酸/苏氨酸激酶,在其结构域内有ATP结合位点、底物结合位点、KIM docking位点、脂质结合位点等。通过多重比对发现不同物种的p38蛋白的氨基酸序列相似度较高,尤其在A-loop和T-G-Y基序上高度保守。系统进化树构建显示E.s-p38蛋白首先与虾蟹类等甲壳纲动物的同源蛋白聚为一类,然后依次和其他节肢动物聚类,与传统的分类学结果基本一致。在获得的E.s-p38基因的cDNA的基础上,使用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测了E.s-p38基因在中华绒螯蟹不同组织内的表达情况,E.s-p38基因在各组织中普遍表达,但在肌肉、肝胰腺、肠、卵巢和精巢中表达较高。为了初步探明E.s-p38基因在中华绒螯蟹生殖中的作用,进一步检测了不同发育时期的精巢中该基因的表达水平发现,E.s-p38基因在精母细胞期、精细胞期和精子期的前期表达没有显著差异,在精子期的中后期表达水平显著上升,这种变化趋势与中华绒螯蟹性腺发育和交配繁殖期呈正相关,初步表明E.s-p38基因可能在中华绒螯蟹精巢发育和精子发生过程中发挥作用。在蛋白层面上,通过Western

Blot实验分析E.s-p38蛋白在中华绒螯蟹精巢不同发育阶段的表达情况。结果显示在精子发生过程中,Es-p38总蛋白表达量逐渐增加,而精细胞期的磷酸化Es-p38蛋白表达水平较精母细胞期与精子期高。利用A23187钙离子载体对中华绒螯蟹成熟精子进行体外诱导顶体反应实验,并通过台盼蓝染色技术计算体外诱导过程中精子的存活率等,通过苏木精／伊红染色技术获得中华绒螯蟹精子在顶体反应过程中所发生的一系列形态变化,保证后续实验的顺利进行。运用免疫荧光技术对处于顶体反应不同阶段的精细胞上的E.s-p38蛋白进行定位,并追踪其随顶体反应过程的进行分布位置如何发生迁移。通过实验我们发现,激活的E.s-p38蛋白主要分布于精子的细胞核和顶体帽部分,并且逐渐在顶体管前段堆积。证实p38 也许 MAPK信号通路可能参与中华绒螯蟹精子顶体反应过程中的调控。综上所述,本论文首次在中华绒螯蟹中证实了p38蛋白的存在,并且从基因与蛋白两个角度论述了p38在中华绒螯蟹精子顶体反应过程中可能发挥的重要作用。本文所取得的研究成果将为进一步探索MAPK信号通路在调控中华绒螯蟹雄性生殖领域的研究提供重要的参考。
目的:观察臭氧抗福尔马林炎性痛中p38/MCP-1信号通路的作用。方法:成年雄性sprague-dawley(SD)大鼠84只,体重250-300 g,测量其机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)的基础值。随机分为空白对照组(C组)、炎性痛组(F组)、F+氧气组(FO2组)、F+臭氧组(FO3组)、F+p38抑制剂组(FSB组)、F+p38抑制剂溶剂对照组(FD组)、F+MCP-1中和抗体组(FM组)。炎性痛组:左足底掌部皮下注射5%福尔马林100μl。福尔马林注射后1 h,FO2组、FO3组患侧足底分别注射纯氧、臭氧(30μg/ml)50μl,FSB组、FD组、FM组鞘内分别注射p38抑制剂SB203580(10μl/rat)、D

以及 MSO(10μl/rat)、MCP-1中和抗体(10μl/rat、1μg/μl)。分别于福尔马林注射后1 h、2 h、4 h、24 h时测定大鼠患侧足机械缩足痛阈(MWT)和热缩足潜伏期(TWL),同时间点取脊髓腰膨大及L4-5背根神经节(DRG),同时用免疫组化(immunohistochemical,IHC)和Western Blot测定脊髓背角和DRG中MCP-1和P-p38含量。结果:1、组织病理学观察:与C组相比,福尔马林注射后1 h,F组、FO2组、FO3组、FSB组、FD组、FM组真皮组织排列紊乱,纤维组织疏松、断裂、炎性细胞浸润;给药后4 h、24 h,与F组相比,FO3组炎性细胞浸润明显降低,有新生成纤维细胞,FO2组、FSB组、FD组、FM组真皮组织排列紊乱,纤维组织疏松,炎性细胞浸润基本一致。2、大鼠痛阈的变化:福尔马林注射前,各组大鼠患侧足底MWT、TWL基础值无差别。与C组相比,建模后F组、FO2组、FO3组、FSB组、FD组、FM组MWT降低,TWL缩短(P<0.01);与F组相比,给药后4h、24h,FO3组、FSB组MWT显著升高,TWL明显延长(P0.05),FM组MWT明显升高,TWL明显延长(P0.05)。IHC与Western Blot结果一致。3.2、MCP-1:与C组相比,其他各组在福尔马林注射后,大鼠脊髓背角和DRG中MCP-1蛋白表达比C组有明显升高(P<0.01),FM组有明显降低(P
背景：绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引发的一种接触传染性肺脏肿瘤疾病。env基因是JSRV的癌基因,透明质酸酶2

(Hyal-2)是JSRV的作用受体。JSRV的囊膜蛋白(Env)转化NIH 一般 3T3细胞是通过其胞质尾(CT)直接激活信号通路；而Env转化上皮细胞,是先与其受体Hyal-2结合,进而激活下游细胞信号通路。目的：绵羊Hyal-2是JSRV Env诱导细胞转化的受体,研究绵羊Hyal-2与Env之间的相互作用,对于揭示JSRV致瘤机理具有重要意义。方法：1.采用绵羊Hyal-2基因真核表达质粒pDsRed-monomer-N1-Hyal-2转染TC-1细胞,经G418筛选、纯化,构建稳定表达绵羊Hyal-2的TC-1细胞系。在核酸水平及蛋白水平上分别利用RT-PCR方法和Western blot方法验证Hyal-2在TC-1细胞内表达的稳定性,并通过激光共聚焦显微镜来观察载体自带红色荧光来确定Hyal-2蛋白在细胞内的定位。2.采用pEGFP-C1-env瞬时转染TC-1细胞、TC-1-Hyal2细胞和NIH 3T3细胞。通过RT-PCR方法和Western blot方法验证Env在上述3种细胞内的表达,同样使用激光共聚焦来观察Env在上述3种细胞内的定位。3.转染pEGFP-C1-env后,通过荧光定量PCR和Western blot方法分别检测其对细胞中AKT、ERK和TERT表达量的影响。结果及结论：1.建立了稳定表达绵羊Hyal-2蛋白的TC-1细胞系,命名为TC-1-Hyal2。2.完成了pEGFP-C1-env真核表达质粒瞬时转染NIH 3T3细胞、TC-1细胞和TC-1-Hyal2细胞。3.转染pEGFP-C1-env后,TC-1-Hyal2细胞和TC-1细胞中AKT、ERK和TERT表达量均升高,并且在TC-1-Hya12细胞中的表达量比TC-1细胞中升高更显著。4.