pn)感染人白血病单核细胞(THP-1)源性的巨噬细胞的细胞感染模型,从而研究C.pn感染对THP-1源性巨噬细胞转化成为泡沫细胞的作用。
PLX3397分子量 方法：体外培养THP-1细胞,采用160nmol/L佛波酯处理48h分化为巨噬细胞后,将细胞随机分为3组：(1)对照组；(2)不同浓度C.pn感染组：分别给予细胞1×105IFU、4×105IFLU、5×105IFU或者1×106IFUC.pn;(3) C.pn感染不同时间组：C.pn感染细胞24h.48h、72h。C.pn是采用水平离心法在体外人喉上皮癌(Hep-2)细胞中培养增殖收获。以上每组细胞均使用含有50μg/ml低密度脂蛋白(LDL)的培养基进行培养,光镜下观察C.pn是否成功感染Hep-2。油红O染色后研究脂滴数目和体积的变化,并进行泡沫细胞计数。 结果：光镜下可见PMA成功将THP-1细胞诱导为贴壁的巨噬细胞,C.pn成功感染Hep-2和THP-1源性巨噬细胞。与对照组比较,细胞内脂滴数目随C.pn感染浓度的增加而增加,随着感染时间增长而增加,脂滴体积也有所增大,泡沫细胞数逐渐增加(p<0.05)。在高浓度(5x105、1×106IFU)和长时间(48、72h)的C.pn感染组中,细胞内脂滴显著增加(p<0.05),而且抑制C.pn感染下调ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达(p0.05)。此外,油红O染色观察到,对于C.pn感染的THP-1巨噬细胞,PPARα刺激剂非诺贝特减少泡沫细胞数,PPARγ刺激剂罗格列酮同样有此效应,而MK886、GW9662和PPARα/γ siRNA则明显促进C.pn诱导THP-1源性巨噬细胞形成泡沫细胞。 结论：PPARα/γ siRNA抑制THP-1源性巨噬细胞内mRNA与蛋白表达效果佳。C.pn在感染THP-1巨噬细胞后,可以减少PPARα/γ、
CD36和ABCA1/G1的基因表达,增加AC ATI和SR-A1的基因表达,而在加入PPARα/γ刺激剂后可减少C.pn对ACAT1、SR-A1和ABCA1/G1的调控影响,而PPARα/γ抑制剂和PPARα/γ siRNA则相反的效应,破坏胆固醇代谢的稳态,诱导巨噬细胞形成泡沫细胞。 第三部分MAPK和PPARα/γ通路交互调控肺炎衣原体感染导致巨噬细胞形成泡沫细胞的过程 目的：以THP-1源性巨噬细胞为研究对象,探讨PPARα/γ和MAPK通路对C.pn导致巨噬细胞形成泡沫细胞的影响。 方法：随机将THP-1巨噬细胞分为8组：(1)对照组；(2)C.pn感染浓度组：给予1×106IFU selleck激酶抑制剂 C.pn感染48h；(3)非诺贝特/罗格列酮(PPARα/γ激动剂)+C.pn感染组：给予含50μmol/L非诺贝特或20μmol/L罗格列酮的培养基预孵育2h后,再给予1×106IFU C.pn感染48h；(4)非诺贝特/罗格列酮组：仅给予50μmol/L非诺贝特或20μmol/L罗格列酮孵育48h;(5) MK886/GW9662(PPARα/γ拮抗剂)+C.pn感染组：给予含20μmol/L MK886/GW9662的培养基预孵育2h后,再给予1×106IFUC.pn感染48h；(6)MK886/GW9662组：仅给予20μmol/L MK886/GW9662孵育48h；(7)MAPK拮抗剂+C.pn感染组：给予含20μmol/L SP600125、50μmol/L PD98059或10μmol/L SB203580的培养基预孵育2h后,再给予1×106IFU C.pn感染；(8)MAPK拮抗剂组：仅给予20μmol/L SP600125、50μmol/L PD98059或10μmol/LSB203580孵育；以上各组细胞均在负荷50μg/ml LDL的条件下进行干预处理及培养。油红O染色后研究脂滴数目和的变化,并进行泡沫细胞计数。Western-blot检测细胞JNK1/2、ERK1/2和p38磷酸化水平的改变,qRT-PCR和Western-blotting进行半定量各组细胞PPARα/γ基因表达。
结果：与对照组相比,C.pn感染可使细胞内JNK1/2、ERK1/2和p38磷酸化(p<0.05)。SP600125和PD98059抑制C.pn感染下调PPARα和PPARγ的mRNA和蛋白表达(p0.05)。此外,油红O染色观察到,SP600125和PD98059明显抑制C.pn诱导THP-1源性巨噬细胞形成泡沫细胞,但SB203580对泡沫细胞的形成无影响。 结论：肺炎衣原体诱导THP-1源性巨噬细胞后,通过MAPK和PPARα/γ交互串联通路,影响C.pn导致巨噬细胞转化成泡沫细胞的过程。
第一部分DCPIB减弱氧糖剥夺诱导的小胶质细胞增殖及促炎因子的分泌 目的：研究氧糖剥夺后DCPIB对小胶质细胞增殖及促炎症因子分泌的影响 方法：采用中国医学科学院细胞中心购买的小胶质细胞BV-2细胞系,将冻存BV-2细胞系经过复苏后种植于多聚赖氨酸包被的24孔塑料培养板中,随机将小胶质细胞分组为对照组、OGD组及OGD+DCPIB组,然后将OGD组及OGD+DCPIB组培养基更换为无糖无血清培养基,同时OGD+DCPIB组给予DCPIB(10μM),置于2%O2的缺氧培养箱l0min后,更换为高糖及无血清培养基并置于37℃、5%CO2常规培养箱3h,然后应用免疫荧光技术将小胶质细胞固定、破膜、封闭、加一抗OX-42与Ki67、TNF-α、IL-Iβ三种分别双染,过夜与4℃冰箱,并次日分别均加三组双染的一抗用二抗CY3及FITC标记的IgG双染,并避光荧光显微镜拍照。计算小胶质细胞细胞Ki67、TNF-α及IL-I GSK1120212体内 β阳性率。运用统计学软件SPSS19.0进行数据统计分析。 结果：小胶质细胞的Ki67阳性表达于胞核上；与对照组相比,OGD组OX-42阳性的小胶质细胞Ki67表达明显升高(P<0.001)；K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞p-GATA1水平下降,分别为K562-MKK3(G1u)细胞和K562(NaB)细胞的30.996%和38.802%(P<0.001)。K562-MKK3(Ala)细胞p-GATA1水平下降,为K562-pcDNA3.1细胞的46.632%(P<0.