PKI-587是一种高效的双向PI3Kα, PI3Kγ和mTOR的抑制剂,其在包括乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肠癌及肝癌在内的多种肿瘤细胞株中都有强烈的抑制生长作用。由于在体外及移植瘤模型中PKI-587都发挥了强效的抗肿瘤作用,因此,为了更好的评估它的抗肿瘤活性,更多的Ⅰ期临床试验(NCT00940498)正在开展中。
在本研究中,我们在体内外水平来研究双向PI3K/mTOR抑制剂的抗肿瘤活性及对辐射敏感性的影响。为了更好的观察双向PI3K/mTOR抑制剂的效果及证实结果的可靠性,我们同时研究了两种双向PI3K/mTOR抑制剂：GSK2126458和PKI-587。我们认为联合双向PI3K/mTOR抑制剂和辐射可以增强鼻咽癌患者的临床疗效,并为今后鼻咽癌的靶向治疗的发展提供理论基础。 方法： 1.细胞增殖实验 细胞增殖实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌增殖的影响。将对数生长期的鼻咽癌细胞以每孔2×103个/100ul接种于96孔板中,贴壁24小时后在每孔中加入不同浓度的GSK2126458或PKI-587或培养基,继续培养72小时。然后,加入50ul的MTT溶液,在37℃的孵箱中培育2小时,移去MTT液,加入100ul的DMSO,在酶标仪下分别检测550nm和630nm处的吸光度。生长分数是以对照组为基准来计算的。每个实验重复至少三次,每次至少3个复孔。 2. Western blot实验 Western blot实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液来裂解鼻咽癌细胞,并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将约40ug的总蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,清洗4遍后,用5%小牛血白蛋白(BSA)在室温下封闭一小时后,加入一抗4℃孵育过夜。再清洗3遍后,加入特异性二抗,在室温下孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测蛋白条带。每个实验至少重复3次。 3.划痕实验 划痕实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移的影响。将细胞以80%-90%的密度种入6孔板中,贴壁24小时后,用0.2ml的枪头在汇合的单层细胞上轻轻滑过,用PBS洗干净划下的悬浮细胞后,加入含有双向PI3K/mTOR抑制剂的无血清培养基或单纯无血清培养基(对照组)培养24小时,并在不同的时间点(0h,12h,24h)拍照,测量划痕宽度。每组3个复孔,每孔随机选取9个含划痕的视野拍照测量,每个实验重复3次。 Selleckchem Necrostatin 1 4.细胞迁移和侵袭实验 细胞迁移和侵袭实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移和侵袭的影响。我们采用transwell小室来检测细胞的迁移和侵袭。Transwell小室的顶部和底部通过含有胶原质的8um的滤过膜分开。在迁移实验中,直接将培养基中含有0.1%BSA的1×105个肿瘤细胞种入小室内,而侵袭实验则需要加铺20-50μg/cm2的BD公司的基质胶在小室内,再种细胞,将含有GSK2126548或PKI-587的培养基加入小室下方。在37℃的孵箱中孵育24小时后,用棉签擦去留在残留在小室内没有迁移或侵袭的细胞。迁移和侵袭到小室下方的细胞则用甲醇固定、结晶紫染色。在200倍显微镜下随机取5个视野计数迁移和侵袭的细胞,每个实验重复3次。
Tacedinaline订单 5.克隆形成实验 克隆形成实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响。4种鼻咽癌细胞株按照不同浓度种入60mm的小皿中。在照射不同剂量射线(0,2,4,6,8Gy)前1小时加入GSK2126548或PKI-587,药物维持24小时后更换培养基。培养约14天后,细胞用甲醇固定,并用0.5%的结晶紫染色。计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率及存活分数。每个实验进行3次,每次3个复孔。运用GraphPad Prism5.0软件进行多靶单击曲线拟合,并绘制存活曲线。采用的多靶单击模型的公式为：SF=1-(1-e-D/D0)N。
6.免疫荧光实验 免疫荧光实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对双链DNA损伤的影响。我们用γ-H2AX抗体来检测DNA双链的断裂损伤。首先,将一定浓度的细胞种在玻片上37℃孵育24小时,然后加入GSK2126548(0.003μM)或PKI-587(0.03μM)孵育1小时后,进行4Gy射线照射,照射后24小时计数细胞内焦点数目。照完射线后24小时先用4%的多聚甲醛固定细胞,再用抗γ-H2AX的一抗4℃孵育过夜,洗掉一抗后,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗。在荧光显微镜下观察DNA损伤。每组5个复孔,每孔至少计数50个细胞,每个实验重复3次。 7.细胞周期实验和细胞凋亡实验 细胞周期及凋亡实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对细胞周期和凋亡的影响。将对数生长期的细胞种入6孔板中,加入GSK2126548或PKI-5871小时后,接受4Gy射线照射,照射后24小时收集细胞,用含有2%胎牛血清的冰PBS洗涤2遍后,加入70%的冰乙醇中-20℃过夜,沉淀、冲洗细胞后,在室温下加入PI染色液染色30分钟。凋亡实验则参照BD公司的annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书进行。使用FACS流式细胞仪的CellQuest软件进行数据分析,所有的实验重复至少3次。 selleck化学 8.动物实验 动物实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂对体内鼻咽癌增殖及辐射敏感性的影响。将5×106个鼻咽癌5-8F细胞制成单细胞悬液,皮下注射于5-7周雌性BALB/c裸鼠右腿外侧。当肿瘤体积达到200mm3时,将小鼠随机分入对照组和实验组(每组5只小鼠)。实验组接受300μg/kg GSK2126458,25mg/kg PKI-587,单纯辐射组,300μg/kg GSK2126458联合辐射或25mg/kg PKI-587联合辐射组。GSK2126458给药方法为：每周连续灌胃5天,1次／天。PKI-587给药方法为：尾静脉注射,1次/5天。辐射组采用直线加速器进行辐射,剂量率为5OOcGy/min,源皮距为100cm,小鼠每隔一天接受2Gy的照射,共4次。联合给药和辐射组则小鼠在给药后2小时接受辐射。每2天测量一次肿瘤大小。肿瘤大小计算公式为：肿瘤体积=(长×宽2)/2。接受处理后12天,当肿瘤体积达到3000mm3时,处死小鼠,取下肿瘤组织用来做Western bolt、免疫组化和TUNEL实验。 9.