NO通过抑制复合体Ⅰ阻止线粒体氧化应激,发挥再灌注心肌保护作用。 2.复合体Ⅰ的抑制作用可能是通过锌激活线粒体Src酪氨酸激酶而引起。
背景 过度的炎症反应是心肌缺血-再灌注损伤(ischemia reperflision injury, IRI)的重要发生机制之一。大量研究证实,适度的调控缺血-再灌注过程中的炎症反应能显著减轻心肌IRI,而且既往研究就发现迷走神经介导的胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, PLX3397订单 CAP)可有效的调控机体的炎症反应。本研究小组的前期工作亦证实,迷走神经电刺激后处理能通过抑制心肌IRI过程中的全身和心脏组织局部炎症反应而减轻心肌IRI。但是直接电刺激迷走神经仍是一种较为复杂的有创操作,并且设备费用较高。因此,寻找一种同样能激动CAP的药物实施替代治疗则更具临床应用前景。
a7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nicotinic acetylcholiner receptor, a7nAChR)是CAP中外周靶细胞接收迷走神经调控信号的感受器。其在识别和接受迷走神经下达的炎症反应调节信号后,将信息传递至细胞内部,进而产生一系列的生物学效应,最终达到免疫调节的作用。a7nAChR激动剂已广泛的应用于各类炎症相关性疾病的治疗研究中。据此我们选择特异性a7nAChR激动剂PNU282987替代直接的迷走神经电刺激后处理,观察其对缺血-再灌注心肌的保护作用。本实验前期的在体研究已初步证实了我们的实验设想,即PNU282987后处理同直接迷走神经电刺激后处理一样,亦能通过抑制IRI过程中的炎症反应而显著减轻心肌组织损伤。但是关于PNU282987后处理心肌保护作用的量效关系以及其保护作用机制目前尚未阐明。 此网站 糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3p, GSK-3p)是真核生物中一种高度保守的多功能丝氨酸／苏氨酸激酶。研究证实激活GSK-3β是缺血-再灌注导致组织损伤的重要机制。活化后的GSK-3β通过放大炎症反应、开放线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)以及激活多条促凋亡途径加剧组织损伤。抑制GSK-3β活性是多种内源性和外源性心肌保护干预措施的共同机制靶点。所以我们推测GSK-3β极有可能是CAP中a7nAChR激动剂PNU282987后处理心肌保护作用的重要机制点。
mPTP过度开放导致线粒体膜电位不可逆性降低,并激活线粒体依赖性凋亡途径是心肌IRI的另一重要发生机制。采取各种措施抑制mPTP过度开放被证实能明显减轻心肌IRI。并且同炎症反应一样,mPTP亦受控于GSK-3p,那么炎症反应和mPTP开放状态在心肌IRI中的相互关系如何?明确这一点将有助于进一步明确a7nAChR激动剂PNU282987后处理的心肌保护作用机制,并且能更加全面的掌握心肌IRI的发生机制。 鉴于上述分析,我们设计了这个随机对照离体细胞实验,研究的主要目的包括：①构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。②在离体细胞层面观察α7nAChR激动剂PNU282987后处理的心肌保护作用并阐明其量效关系；③观察GSK-3β在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位；④探究mPTP与炎症反应在心肌IRI中的相互关系,以及两者在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位和相互关系。 第1部分新生鼠心肌细胞体外培养和离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型的建立 本部分实验的目的是建立成熟、稳定和高质量的心肌细胞体外培养方法,并在此基础上采用厌氧法构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧(anoxia/reoxygention)损伤模型。 采用0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶混合多次消化法分离1-2d SD新生鼠心肌细胞,1h差速贴壁结合5-BrdU化学抑制法纯化心肌细胞。倒置相差显微镜镜下观察细胞活性并通过心肌肌钙蛋白T(Cardiac
troponia T, cTnT)免疫荧光法复合细胞核4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine 不 dihydrochloride, DAPI)染色法鉴定心肌细胞纯度。 采用厌氧培养法构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。心肌细胞培养72h后,随机分为7组：Sham组(空白对照组),心肌细胞正常培养不进行任何处理；3h组,心肌细胞仅接受缺氧3h的处理；3h/6h组,心肌细胞接受缺氧3h和复氧6h的处理；6h组,心肌细胞仅接受缺氧6h的处理；6h/6h组,心肌细胞接受缺氧6h和复氧6h的处理；9h组,心肌细胞仅接受缺氧9h的处理；9h/6h组,心肌细胞接受缺氧9h和复氧6h的处理。实验结束后,采用专用的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,膜联蛋白V/碘化丙啶(propidine iodide, PI)(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况。 倒置相差显微镜下观察,心肌细胞活性高、收缩有力,48-72h出现同步化搏动,形成功能上的合胞体。cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定心肌细胞纯度达到(94.2+2.