9%生理盐水中至50μl）制备肺纤维化模型，正常组则滴注0.9%生理盐水50μl，造模当日，SP组给予SP600125（按15mg/Kg溶于DMSO液中至0.03ml）腹腔内注射，其余三组给予DMSO液0.03ml腹腔内注射，一次性给药。SB组于造模后第3、4、5天腹腔内注射SB431542（按4.2mg/Kg，浓度为0.5mg/ml，溶媒为10%乙醇），其余3组给予等体积10%乙醇。分别于模型制备后的第7、14、28天随机抽取每组小鼠各8只，采用腹主动脉放血法处死，留取肺组织。通过HE染色和Masson染色，观察肺泡炎和肺纤维化程度并进行评分；碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量；免疫组化法测α-SMA的定位，Western 哪里 blot检测p-JNK，p-Smad3、α-SMA的表达水平。 结果：1、HE及Masson染色：M组于第7天时出现明显的肺泡炎性改变，第14天时出现纤维化改变，第28天时肺泡炎症减轻，形成明显的纤维化改变。SP组及SB组较M组比较，肺泡炎及肺纤维化的程度均有所减轻。2、羟脯氨酸含量测定：M组各时间点较N组含量升高（P＜0.05)；第14、28天时SP组、SB组较M组含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05)；第14、28天时SB组较SP组含量低，差异有统计学意义（P＜0.05)。3、免疫组化结果：α-SMA主要定位于肺内气管、血管周围的平滑肌细胞及肺纤维化后大量增生的肌成纤维细胞细胞中。在N组肺组织中，各时间点α-SMA蛋白表达甚微，仅可在较大血管、支气管壁的平滑肌细胞质中呈阳性表达；M组α-SMA蛋白除表达在支气管壁、血管的平滑肌细胞质中，还可在肺间质的肌成纤维细胞质中表达，其表达量随时间延长缓慢增加，第28天时最明显（P＜0.05）；SP组和SB组在各时间点较M组表达降低（P＜0.05）。
4、Western blot结果：与N组比较，M组在第7、14、28天p-JNK、p-Smad3及α-SMA的表达量均升高（P＜0.05）；与M组比较，SP组及SB组各蛋白的表达量在7、14、28天均降低（P＜0.05）；在14、28天，SB组与SP组比较，各蛋白表达量降低（P＜0.05)。 结论：Smad与JNK信号通路可以诱导肌成纤维细胞的形成，从而在肺纤维化发生发展过程中发挥作用；JNK和Smad途径在肌成纤维细胞的形成过程中是相互作用的，JNK的活化可以加强Smad3的磷酸化，同时，JNK的磷酸化也需Smad途径的活化。
研究背景：特发性肺纤维化（idiopathic
pulmonary fibrosis，IPF）是特发性间质性肺炎（idiopathic interstitial pneumonia，IIP）中慢性致纤维化疾病中的一类,多数患者呈慢性经过，但本病预后不佳，病死率甚高。而导致其发生的病因及机制目前尚未完全阐明。已有研究发现肺纤维化小鼠或患者的肺泡上皮细胞存在过度凋亡，可能引起组织的异常修复，从而使成纤维细胞活化，转型，纤维组织增生。因此细胞凋亡参与肺纤维化形成的机制渐渐成为研究的热点。转化生长因子β1（TGF-β1）被发现可以参与多种细胞的凋亡，但具体机制并不十分清楚。已有一部分实验结果表明c-jun末端激酶（JNK）可以促进细胞凋亡。国外又有研究指出TGF-β1可通过其下游的效应分子smad2/3与JNK信号通路相互作用。但关于二者是否均可以通过介导细胞凋亡参与特发性肺纤维化的形成及二者是否存在一定的关系的研究甚少，故本课题对此展开研究，以进一步探索特发性肺纤维化的发病机制，为临床的诊治提供一定的依据。 http://www.selleckchem.cn/products/ABT-263.html 目的：研究博来霉素肺纤维化小鼠中细胞凋亡情况及p-jnk，p-smad3蛋白的表达，来探讨JNK与TGF-β1/Smad3信号通路介导的细胞凋亡在特发性肺纤维化中的作用机制及相互关系。
方法：96只雄性C57BL/6小鼠（20±2g）随机分为4组，每组24只，分别为正常对照组（N组)、肺纤维化模型组(M组)、肺纤维化+TGF-β1/Smad3阻断组(SB组)，肺纤维化+JNK阻断组(SP组)。M组一次性气管内注入博来霉素溶液0.09ml/只，(按3.5mg/kg）制造肺纤维化模型，对照组给予等剂量0.9%氯化钠气管注入；SP组用同样方法造模并于造模当日一次性腹腔注射JNK阻断剂SP600125，0.03ml/只（按15mg/kg，用DMSO溶解）；SB组用同样方法造模并于造模后的第3、4、5天经腹腔注射TGF-β1/Smad3阻断剂SB431542（按4.2mg/kg，用100%乙醇溶解）。各组分别于造模后第7、14、28天随机取8只小鼠经腹主动脉放血法处死，留取右肺上叶置中性甲醛中固定，石蜡包埋切片行苏木素-伊红（HE）染色，Masson染色观察，TUNEL法观察细胞凋亡；留取右肺中下叶组织用于测定羟脯氨酸含量；左肺组织经western MK-1775制造商 blot检测caspase3，p-jnk，p-smad3蛋白的表达。 结果：1. M组HE染色、Masson染色结果与正常对照组相比，在造模后第7天呈肺泡炎性改变，之后炎症有所减轻，纤维化程度逐渐加重，第28天呈明显纤维化改变；M组羟脯氨酸含量随时间推移，逐渐增加，28天时含量最高（p＜0.05）；M组肺泡上皮等细胞凋亡指数明显高于正常对照组，7天开始增强，第28天达高峰（p＜0.05），且M组可以检测到caspase3活化后的17kd蛋白高表达；M组p-JNK、p-smad3的含量较正常对照组各时间点均增加（p＜0.05）；2. SP组、SB组各时间点炎症细胞浸润明显减少，纤维化程度、羟脯氨酸含量、肺泡上皮细胞凋亡指数及caspase3活化后的蛋白含量较M组均有所减轻，但仍高于对照组（p＜0.05）；3. SP组对比与M组p-JNK表达明显下降，p-smad3表达也有所下降；4. SB组p-smad3的表达较模型组明显下降，p-JNK的表达也有一定程度的下降（p＜0.