8LPS诱导的RAW264.7炎症细胞中MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路对NF-κB信号通路的影响 抑制剂组分别加入p38、ERK、JNK和JAK通路抑制剂干预细胞。LPS刺激1h后提取RNA及总蛋白,利用RT-PCR技术检测NF-κB

p65mRNA表达,利用Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达情况,以探索炎症状态下MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路对NF-κB信号通路的影响。 研究结果： 1、黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及作用机制探讨 造模后,大鼠出现血便、稀便、懒动、竖毛、毛泽无光、体重下降等症状,结肠组织出现明显溃疡,提示造模成功。经药物干预后,各给药组大鼠的症候学和病理学有不同程度的改善。黄芩汤高、中剂量组大鼠饮食量和体重经治疗后显著好转,血清中NO、IL-6、TNF-α、PGE2水平,结肠组织NF-κB selleck compound p65表达量及组织损伤程度均较模型组显著减轻。模型组大鼠上述指标与正常组相比有显著性差异。 2、黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的抗炎作用及作用机制探讨 2.1与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,释放的炎症介质NOΟ、IL-6、TNF-αPGE2含量显著升高,提示造模成功。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,对炎症细胞释放的NO、IL-6、TNF-α和PGE2都有不同程度抑制的作用。 2.2与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,炎症细胞内NF-κB p65基因及蛋白表达显著升高,且细胞核内的蛋白比细胞浆的表达高。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,炎症细胞内NF-κB p65基因及蛋白表达显著下降,高剂量黄芩汤组细胞核内NF-κB p65蛋白表达比细胞浆低,说明黄芩汤对炎症细胞内NF-κB p65表达有抑制作用,并可抑制NF-κB p65由胞浆向胞核转移。 2.3与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,炎症细胞内p38、ERK和JNK基因及蛋白表达显著升高。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,炎症细胞内p38、ERK和JNK基因及蛋白表达显著下降,说明黄芩汤对炎症细胞内p38、ERK和JNK的表达均有抑制作用。

还有 2.4与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,炎症细胞内JAK基因及蛋白表达显著升高。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,炎症细胞内JAK基因及蛋白表达显著下降,说明黄芩汤对炎症细胞内JAK的表达有抑制作用。 2.5与模型组相比,p38通路抑制剂组细胞内NF-κB p65基因及蛋白表达均显著下降,ERK、JNK通路抑制剂组细胞内NF-κB p65蛋白表达量与模型组相比显著降低,JAK-STAT通路抑制剂组NF-κB p65基因表达有降低的趋势。说明炎症状态下,p38信号通路可显著调节NF-κB p65的表达,ERK、JNK和JAK-STAT通路对NF-κB通路的影响较小。 研究结论： 1、黄芩汤可通过减少NO、IL-6、TNF-α和PGE2炎症介质的释放来发挥抗炎作用。 2、黄芩汤可通过抑制NF-κB的活化来发挥抗炎作用,进而下调炎症介质NO、IL-6、 TNF-α和PGE2的表达。 selleck化学s 3、黄芩汤可通过抑制MAPK和JAK-STAT信号通路活化来发挥抗炎作用。

4、MAPK信号通路中的p38通路对NF-κB通路有较强的调节作用,ERK、JNK和JAK-STAT通路对NF-κB通路也有调节作用,但是效果没有p38通路明显。
肾脏纤维化是慢性肾脏病进展的主要病理生理因素，可缓慢、进行性发展至终末期肾脏病，给社会及家庭带来沉重的经济负担。黄芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)是中药黄芪的主要有效成分之一，临床实践及现代药理提示黄芪对延缓慢性肾脏病进展具有显著作用[1]。目前黄芪甲苷对肾纤维化的作用尚不明确，本研究围绕黄芪甲苷对肾纤维化的作用机制进行探讨。 目的：明确黄芪甲苷对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型发生肾脏纤维化的干预作用，明确黄芪甲苷对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用，并初步探讨其作用机制。 方法：雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham组）（n=8）、模型组（UUO组）（n=10）、黄芪甲苷干预组（AS-IV组）（n=10）。模型组和黄芪甲苷干预组均采用单侧输尿管结扎（UUO）建立肾纤维化模型，Sham组不做输尿管结扎余操作相同。黄芪甲苷干预组在术后当天及其后连续7天给予AS-IV20mg/(kg×d)灌胃，Sham组及UUO组小鼠同时给予等量溶剂灌胃。分别于术后第7、14天采集双侧肾组织标本，记录肾重及体重。肾组织切片行HE、MASSON染色，观察病理改变情况。采用TUNEL法检测肾组织的细胞凋亡情况。采用蛋白质免疫印迹（western blotting）及实时定量荧光PCR（real-time PCR）法，分别检测纤连蛋白(fibronectin)、collagen IV、α-SMA、TGF-β1表达，并western blotting观察p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK蛋白表达情况。 体外培养人肾小管上皮细胞株（HK2），分为正常组（Ctl）、模型组（TGF-β1）、黄芪甲苷干预组（AS-IV）。模型组和干预组均采用TGF-β1（10ng/ml）刺激细胞，干预组同时加入不同浓度的AS-IV（50,100,200ug/ml），刺激后12,24,48h收集各组细胞。提取细胞蛋白样品，western blotting检测纤连蛋白、collagen IV、α-SMA表达情况。CCK8法检测细胞活性，TUNEL法检测细胞凋亡，并检测p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK信号蛋白表达水平。进一步研究提前30分钟给予SB203580(10μM)抑制p38磷酸化，探讨并对比其与AS-IV对肾小管上皮细胞的保护作用。 结果：术后第14天UUO组小鼠梗阻侧的肾重/体重比值（KW/BW）较对侧显著下降（P<0.05），AS-IV组梗阻侧肾脏纤维化改变显著减轻（P<0.05）。UUO组梗阻侧肾脏细胞凋亡较Sham组显著增加（P<0.05），术后14天AS-IV组的细胞凋亡程度较UUO组减轻（P<0.05），而黄芪甲苷干预显著改善MAPK信号蛋白的激活（均P<0.05），细胞凋亡增多（P<0.