5％琼脂糖凝胶电泳后，成像分析。 Western blot：收集转染组和对照组细胞，提取总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。经凝胶成像系统采集，进行灰度值测定，以β-actin为内对照，计算Survivin的相对表达量。 MTT比色分析法和Annexin V-FITC／PI双标记流式细胞术检测其对T47D细胞增殖和凋亡的影响。
(3)收集转染组和各对照组细胞，提取总蛋白，Western blot检测对JNK信号通路关键分子MKK7-JNK1／2-c-Jun蛋白表达的影响。 结果 (1)49例乳腺癌中Survivin蛋白表达率为71.6％，浸润性导管癌阳性表达率最高(75.6％)，其次为导管内癌(58.5％)、重度非典型增生(55.6％)，中度非典型增生(36.4％)。轻度非典型增生(16.7％)。其中浸润性导管癌阳性表达率显著高于中度非典型增生病例。JNK1／2在乳腺癌中高表达率为69.4％，在浸润性导管癌和导管内癌中阳性高表达率相近，分别为70.3％和66.7％，依次略高于重度非典型增生(55.6％)、中度非典型增生(45.5％)和轻度非典型增生(33.3％)。在组织学Ⅰ级病例中JNK1／2高表达率为83.1％，高于在组织学Ⅱ级和Ⅲ级中的表达率。两者的阳性表达与有无淋巴结转移无明显关系。统计学分析表明两种蛋白在乳腺癌中表达有一定的相关性。 selleck化学药品 (2)反义Survivin寡核苷酸转染T47D细胞，转染后Survivin mRNA和蛋白表达均下调(分别下调了57.9％和35.0％)，P＜0.05。MTT分析，转染组细胞生长抑制率高于空白对照组。流式细胞术检测发现，转染反义Survivin后，T47D细胞的凋亡率明显增加。 (3)反义Survivin转染T47D细胞，转染后除了下调Survivin的蛋白表达外，MKK7、JNK1／2和c-Jun蛋白的表达也有不同程度的降低。结论 (1)Survivin和JNK1／2在乳腺癌及导管上皮非典型增生病变中均有表达，且两者在乳腺癌中的表达具有一致性。 (2)反义Survivin可下调乳腺癌T47D细胞Survivin mRNA和蛋白的表达，并诱导T47D细胞凋亡，抑制其增殖。 (3)反义Survivin可下调乳腺癌T47D细胞JNK信号通路关键分子的表达。
背景：糖尿病血管病变严重，发病年龄轻，进展快，累及范围广，并且伴有严重的侧支动脉发育受损，是造成糖尿病死亡的主要原因。内皮祖细胞(EPC)是骨髓干细胞的一种亚群，是血管内皮细胞的前体细胞，不仅在血管新生中作用显著，也有强烈的内皮保护作用。成年人体内存在骨髓内皮祖细胞(BM-EPC)和循环内皮祖细胞(circulating EPC)，后者又具有两种亚型，循环早期内皮祖细胞(early EPC)和循环晚期内皮祖细胞(late EPC)。研究发现，无论是1型还是2型糖尿病，其内皮祖细胞的增殖、黏附、整合入血管结构以及成血管能力均显著下降，糖尿病血管病变与其内皮祖细胞功能不全密切相关。然而糖尿病影响内皮祖细胞功能的机制、糖尿病对不同来源内皮祖细胞功能影响是否存在差别、内皮祖细胞移植是否会改善高糖环境下缺血心肌的灌注等远未明确。
目的：1．探讨BM-EPC和late EPC的生物学特征差异。2．探讨高糖、高胰岛素对体外培养的BM-EPC和late EPC增殖以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达的影响。3．探讨四氧嘧啶诱导的糖尿病对兔BM-EPC和late EPC集落形成能力以及增殖和黏附功能的影响。4．探讨糖尿病来源的BM-EPC和late EPC心肌内移植对四氧嘧啶诱导的糖尿病兔急性心肌梗死的修复作用。 方法：1．分别抽取健康兔骨髓4ml和外周血10ml，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF的DMEM／DF12或M199培养液中培养BM-EPC和late 一般 EPC；流式细胞仪检测两种细胞的细胞表面标志CD14、CD34、CD45、CD54、CD105、CD106、CD133、KDR和vWF的阳性率；激光共聚焦显微镜检测两种细胞吞噬ac-LDL以及结合UEA-1的能力。2．收集健康兔来源的P2代BM-EPC和late 那个 EPC，分为5组：对照组(5.5mmol／l葡萄糖)，glucose11组(11mmol／l葡萄糖)，glucose30组(30mmol／l葡萄糖)，ins100组(100nmol／l胰岛素)，ins1000组(1000nmol／l胰岛素)，采用不同浓度的葡萄糖和胰岛素刺激。MTT法检测刺激48小时和96小时后两种细胞的增殖能力。RT-PCR法检测两种细胞在接受高糖、高胰岛素刺激96小时后VEGF和bFGF
mRNA表达的水平。3．四氧嘧啶诱导兔糖尿病模型后4周，培养糖尿病组(n=6)和对照组(n=6)动物BM-EPC和late EPC。分别检测原代培养的两组BM-EPC和late EPC集落形成数，以MTT法检测细胞增殖，并检测细胞对纤维连接蛋白的黏附能力。4．四氧嘧啶诱导糖尿病模型后将动物分为对照组(n=8)，骨髓内皮祖细胞移植组(n=8)和循环晚期内皮祖细胞移植组(n=8)。糖尿病造模6周后结扎动物前降支造成急性心肌梗死模型，之后于对照组心肌内注射M199培养液200μl，骨髓内皮祖细胞移植组注射BM-EPC 5×10~6，循环晚期内皮祖细胞移植组注射late EPC 5×10~6。以激光共聚焦显微镜观察移植细胞的分布；以Masson三色染色法检测细胞移植后心肌纤维化面积；以Ⅷ因子免疫组化法标记毛细血管，计算毛细血管密度；以心脏超声观察心功能的改变；以实时定量PCR检测VEGF和bFGF的表达。 结果：1．BM-EPC与late EPC CD14，CD54，CD105，KDR，vWF阳性率无差异(P＞0.05)；BM-EPC CD45，CD133阳性率高于late EPC(P＜0.05)；BM-EPC的CD34和CD106阳性率低于late EPC(P＜0.05)；两种细胞都能吞噬ac-LDL并结合UEA-1，吞噬ac-LDL的能力相当(P＞0.05)。2．高糖刺激48小时对BM-EPC增殖功能无明显影响(P＞0.05)，刺激96小时后11mmol／l的葡萄糖促进BM-EPC的增殖(P＜0.05)，而30mmol／l葡萄糖与对照组无明显差别(P＞0.05)。高糖刺激48小时后，随着葡萄糖浓度的增加，late EPC增殖能力逐渐减弱(P＜0.05)；刺激96小时后葡萄糖仍呈浓度依赖性抑制late EPC增殖，glucose11组增殖能力较对照组明显下降(P＜0.05)，glucose30组不但较对照组(P＜0.01)也较glucose11组(P＜0.05)明显下降。胰岛素刺激48小时可以促进BM-EPC的增殖，ins100组和ins1000组细胞增殖均较对照组增高(P＜0.05)；而随着培养时间的延长胰岛素的促增殖作用则逐渐减弱(P＞0.