5。C。大鼠被固定在立体定位架上,并且于右侧冠状缝旁开中线3.5mm处钻孔。用26号针头通过立体定向插入右侧基底节(在前囟前方0.2mm,腹侧5.5mm,旁开3.5mm处)。自体全血(100μl)以10μl/min的速度通过微泵注入,留针5分钟,后拔除针头,无菌骨腊封闭颅骨小孔,缝合皮肤。在空白对照组中,采用等量生理盐水取代自体血以外,其余操作相同。 (3)实验大鼠分组和治疗:模型建立成功后,脑出血大鼠随机分为两组(n=60),一组给予去铁敏治疗(100mg/kg,腹腔内注射,出血后2小时给药,随后间隔12小时给药一次),另一组给予同等量的生理盐水(给药方式同去铁敏组)。脑出血两组与空白对照组均分别于术后第1、3、7、14及28天处死同等数量模型(n=12),用于脑脊液游离铁含量、脑组织总铁含量测定以及分别用蛋白印迹和免疫组化的方法检测脑组织内HO-1表达水平。

点击此处 (4)脑脊液采取及游离铁检测:大鼠经苯巴比妥麻醉后,穿刺枕大池采取脑脊液,并冻存于-80℃冰箱用于统一检测。脑脊液内游离铁的检测采用Nilsson法。 (5)脑组织总铁含量检测:大鼠经苯巴比妥麻醉后,用生理盐水灌流取脑,沿针道前后2mm切去脑组织块,取同侧及对侧基底节、称重,然后用0.1M PBS液将脑组织打成匀浆并保存于-80℃冰箱用于统一检测。组织内总铁(μg/g)测定采用Fish法。 (6)检测血肿周围组织HO-1表达水平: ①蛋白印迹法(western blot):实验大鼠经苯巴比妥麻醉后开胸暴露心脏,用生理盐水灌流取脑,沿针道前后2mm切去脑组织块,分离同侧与对侧基底节。蛋白浓度测定使用Bio-Rad蛋白测试盒。每个标本取50μg蛋白质,通过凝胶电泳法使之分离,再将其转移到硝化纤维膜(Amersham)上。应用一抗的1:1500的稀释液(兔抗大鼠多克隆HO-1)以及二抗的1:2000稀释液(过氧化物酶共轭的山羊抗兔抗体。抗原抗体复合物通过化学发光系统而显影,应用Kodak X-OMAT胶片摄片。条带的相对密度应用NIH Image(Version 1.61)分析。 ②免疫组织化学(immunohitochemistry)法:实验大鼠经苯巴比妥麻醉后开胸暴露心脏,先用生理盐水后用4%多聚甲醛/0.1MPBS灌流取脑,取出脑组织并保存在4%多聚甲醛0.1MPBS(PH 7.4)中24小时,然后移入30%蔗糖-0.1MPBS(PH 7.4)缓冲液中置4℃冰箱中过夜至沉底,取出脑组织采用OCT胶包埋并冻存于深低温冰箱。切片时取出冰冻组织块入恒冷切片机,行18μm连续冠状面切片,收集血肿周围连续切片,裱于多聚赖氨酸处理载玻片上,风干,-20℃保存备用。免疫组化检测采用ABC法,采用一抗为兔抗大鼠多克隆HO-1(1:400)、二抗为生物素化的山羊抗兔IgG(1:800)。 (7)行为学检查:所有实验大鼠在术前及术后(直至处死前)均进行行为学检查,用于评估神经功能损害及恢复情况。检查者对实验大鼠情况并不了解,从而保证检查的公正性。我们采用3种行为学检查手段:转身实验、前肢上抬实验及前肢应用协调性实验

因为 ①转身实验(corner test):观察大鼠在30°夹角转身并记录方向,向左或向右,重复12次。当右侧基底节受损时,大鼠将倾向于向右转身,比较向右转身的百分比。 ②前肢上抬实验(Forelimb Placing test):观察大鼠在轻触患侧触须时,对侧前肢上抬并成功触及桌面的情况,重复10次。当右侧基底节受损时,大鼠左侧前肢出现无力症状,比较左侧上肢成功上抬的比例。 ③前肢应用协调实验(Forelimb use asymmetry test):将大鼠至于透明塑料圆筒内,观察它在3～10分钟内(取决于大鼠的活跃程度)两侧前肢分别或同时扒在圆筒壁上情况,并分别记录健侧前肢(I)、患侧前肢(C)以及两侧同时上扒(B)的次数,总共计数20次,统计前肢应用协调评分=[I/(I+C+B)]-[C/(I+C+B)]。 (8)统计学检查:计量资料以平均数±标准差表示,运用Statview 5.0.1统计软件进行处理,数据采用Anova检验、t检验以及pearson相关性分析,显著性差异设置为p＜0.05。 2结果 (1)实验大鼠生理参数:所有实验大鼠的生理参数在术前及术后1小时立即进行检测。平均动脉压、血PH、PaO_2、PaCO_2、红细胞压积(Hematocrit,Hct)以及血糖均控制在正常范围(平均动脉压:70～100mmHg、血PH:7.4～7.5、PaO_2:80～120mmHg、PaCO_2:35～45mmHg、Hct:38%～43%、血糖:80～130mg/dl)。

(2)脑出血后大鼠脑脊液内游离铁水平变化 正常情况下大鼠正常脑脊液内游离铁水平非常低(1.1±0.4μmol/L),脑出血后,游离铁水平在一天内(8.5±1.3μmol/L)迅速上升,在3天后达到高峰(14.2±5.0μmol/L),此后直至术后28天维持在一个较高的水平(6.2±1.1μmol/L)。去铁敏治疗能显著降低出血后每个时间点脑脊液内游离铁水平的上升(如在术后第3天:去铁敏治疗组为6.7±2.0μmol/L:对照组14.2±5.0μmol/L,p＜0.05)。 Selleckchem Silmitasertib (3)脑出血后大鼠脑组织内总铁水平变化 脑出血后患侧脑组织总铁水平同样明显升高(如术后第1天:患侧为264±55μg/g:健侧87±13μg/g,p＜0.01),且在出血后28天内始终维持一个较高的水平。去铁敏治疗并不能降低各个时间点患侧总铁水平(如术后第3天:治疗组为227±41μg/g:对照组243±46μg/g,p＞0.05)。 (4)脑出血后血肿周围组织HO-1表达水平 在正常脑组织以及生理盐水注射对照组中HO-1的免疫活性非常低,而脑出血后HO-1蛋白表达水平显著升高。免疫组化检测显示:脑出血后1d即可在血肿周围组织内发现HO-1阳性细胞显著增多,蛋白印迹检测显示:较之生理盐水注射对照组,脑出血后1d血肿周围HO-1蛋白表达水平显著升高(1652±384 versus 208±72),在出血后3天达到高峰,此后HO-1表达水平虽逐渐下降,但直至出血后28天仍可检测出HO-1蛋白活性。去铁敏治疗能轻微上调脑出血后脑组织内HO-1蛋白的表达水平。 (5)脑出血后神经功能损害及去铁敏的干预效果 脑出血后神经功能明显损害,而去铁敏治疗则显著改善了神经功能的损害程度。三种行为学检查均显示在各个时间点去铁敏治疗的有效性。如转身实验第7天:治疗组为69.6±20.0%:对照组83.9±16.