3%,接近半数抑制浓度(IC5o)。HE染色结果显示：云芝氯仿萃取物处理的肝癌HepG-2细胞,与对照组相比细胞间距增大,细胞变小、失去原有形态、细胞核皱缩、染色变深、细胞碎裂、可见凋亡小体,并目随着时间和剂量的增加凋亡程度越严重。DNA

查找更多 ladder方法检测结果显示,与对照组相比较,云芝氯仿萃取物低、中、高剂量组作用48h时HepG-2细胞DNA降解成DNA片段,并随着剂量增加,降解作用越明显。Western方法检测云芝氯仿萃取物作用HepG-2细胞48h后,用药组与对照相比,凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达均有显著性改变：其中Bc1-2蛋白表达显著下降(P<0.01),Bax、Caspase-3蛋白表达显著升高(P
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以多对称性关节炎为主要临床表现的慢性自身免疫功能障碍性疾病。关节滑膜炎症细胞浸润、血管新生增多、滑膜血管翳形成、软骨及骨组织侵蚀是RA的主要病理学特征。血管新生是产生和维持RA血管翳的必需条件，因此，抑制血管新生可能是治疗RA的一个新的靶点。本课题组前期体内实验研究发现穿山龙总皂苷可以减少胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠关节滑膜组织的新生血管数量，显著性下调血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体的表达，进一步证明了抑制血管新生可以作为治疗RA的靶点，抑制血管新生是穿山龙总皂苷治疗RA的机制之一；在体外，IL-17联合TNF-α能够刺激大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞分泌大量VEGF，此作用可以被核转录因子-κB(nucleartranscription factors-κB，NF-κB)特异性阻断剂PDTC部分阻断，说明NF-κB途径不是调控VEGF产生的唯一途径；并且在实验中证实穿山龙总皂苷能够抑制炎性因子诱导的RSC-364细胞VEGF的分泌。 本研究在前期对穿山龙总皂苷抑制血管新生作用的研究基础上，以胶原诱导性关节炎大鼠(CIA)和大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞模型为研究对象，通过体内、体外实验观察穿山龙总皂苷对NF-κB p65、信号转导子和转录激活因子3(signal

NVP-BGJ398数据表 transducer and activator of transcription3，STAT3)及激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)表达的影响，进一步阐明穿山龙总皂苷通过抑制血管新生治疗RA的调控机制。 第一部分穿山龙总皂苷对CIA大鼠关节滑膜组织NF-κB p65、STAT3及AP-1表达的影响 目的： 通过观察穿山龙总皂苷对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠滑膜组织NF-κB p65、STAT3及AP-1表达的影响，深入探讨穿山龙总皂苷抑制类风湿性关节炎血管新生可能的信号转导通路作用机制。 方法： 健康清洁级Wistar大鼠100只，随机取24只做正常对照组，其余76只大鼠均建立CIA模型。将造模成功的72只CIA大鼠随机分为3组：CIA模型组、雷公藤组(阳性对照组)、穿山龙总皂苷组，每组24只。在初次免疫后第16d起，雷公藤组大鼠给予雷公藤多甙片(12mg·kg﹣1·d﹣1)灌胃，穿山龙总皂苷组大鼠给予穿山龙总皂苷(25mg·kg﹣1·d﹣1)灌胃，正常组和CIA模型组大鼠分别给予等体积溶媒(0.5%CMC)灌胃，各组连续用药时间均为35d。 分别于16d，23d，30d，37d，44d，50d观察各组大鼠关节炎指数(arthritisindex，AI)评分的变化情况；应用TransAMTMNF-κB p65活性检测试剂盒检测滑膜组织中NF-κB p65的DNA结合活性；免疫组织化学染色方法观察滑膜组织中STAT3蛋白的表达；原位杂交方法检测滑膜组织AP-1的两个亚单位c-fos和c-jun的mRNA表达水平；凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)检测滑膜组织核蛋白提取物AP-1的DNA结合活性。 结果： 1大鼠治疗前后不同时间点关节炎指数(AI)评分 大鼠初次免疫后14d逐渐出现足趾部及踝关节皮肤发红，轻度肿胀等关节炎症状。造模成功分组以后分别于16d，23d，30d，37d，44d，50d检测各组大鼠AI评分，CIA模型组大鼠AI值在不同时间点与正常对照组相比均有显著性差异(P＜0.01)；雷公藤组、穿山龙总皂苷组均可明显抑制CIA大鼠AI值(P＜0.01)；两治疗组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。

2各组大鼠滑膜组织核蛋白提取物NF-κB p65的DNA结合活性 Epigenetics合成 Library体外 CIA模型组与正常对照组比较，大鼠滑膜组织核蛋白提取物中NF-κBp65的DNA结合活性显著增高(P＜0.01)；与CIA模型组相比，雷公藤组、穿山龙总皂苷组的NF-κB p65DNA结合活性均显著降低(P＜0.01)；两治疗组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。 3各组大鼠关节滑膜组织STAT3蛋白的表达 STAT3免疫组化阳性产物黄色或棕黄色颗粒主要分布于细胞浆，少量在细胞核中。STAT3蛋白在CIA模型组大鼠关节滑膜中的表达与正常对照组相比显著增多(P＜0.01)；与CIA模型组相比，雷公藤组、穿山龙总皂苷组STAT3蛋白的表达均显著减少(P＜0.01)；两治疗组之间两两比较无统计学意义(P＞0.05)。 4各组大鼠关节滑膜组织中c-fos mRNA的表达 c-fos mRNA阳性信号主要分布于细胞浆，细胞浆显黄色或棕黄色颗粒为阳性反应。与正常对照组相比， CIA模型组大鼠关节滑膜组织可见到大量细胞浆染成棕黄色至棕褐色，c-fos mRNA的表达水平显著增多(P＜0.01)；与CIA模型组相比，雷公藤组、穿山龙总皂苷组c-fos mRNA的表达水平均显著减少(P＜0.01)；两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。 5各组大鼠关节滑膜组织中c-jun mRNA的表达 c-jun mRNA阳性反应主要分布于细胞浆，细胞浆显黄色或棕黄色颗粒。与正常对照组相比， CIA模型组大鼠关节滑膜组织可见到大量细胞浆染成棕黄色至棕褐色，c-jun mRNA的表达水平显著增多(P＜0.01)；与CIA模型组相比，雷公藤组、穿山龙总皂苷组c-jun mRNA的表达水平均显著减少(P＜0.01)；两治疗组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。 6各组大鼠滑膜组织核蛋白提取物AP-1的DNA结合活性 与正常对照组比较，CIA模型组滑膜组织核蛋白提取物AP-1的结合活性显著增高(P＜0.01)；与CIA模型组相比，雷公藤组、穿山龙总皂苷组的AP-1DNA结合活性均显著降低(P＜0.