NO通过抑制复合体Ⅰ阻止线粒体氧化应激,发挥再灌注心肌保护作用。 2.复合体Ⅰ的抑制作用可能是通过锌激活线粒体Src酪氨酸激酶而引起。
背景 过度的炎症反应是心肌缺血-再灌注损伤(ischemia reperflision injury, IRI)的重要发生机制之一。大量研究证实,适度的调控缺血-再灌注过程中的炎症反应能显著减轻心肌IRI,而且既往研究就发现迷走神经介导的胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, PLX3397订单 CAP)可有效的调控机体的炎症反应。本研究小组的前期工作亦证实,迷走神经电刺激后处理能通过抑制心肌IRI过程中的全身和心脏组织局部炎症反应而减轻心肌IRI。但是直接电刺激迷走神经仍是一种较为复杂的有创操作,并且设备费用较高。因此,寻找一种同样能激动CAP的药物实施替代治疗则更具临床应用前景。

a7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nicotinic acetylcholiner receptor, a7nAChR)是CAP中外周靶细胞接收迷走神经调控信号的感受器。其在识别和接受迷走神经下达的炎症反应调节信号后,将信息传递至细胞内部,进而产生一系列的生物学效应,最终达到免疫调节的作用。a7nAChR激动剂已广泛的应用于各类炎症相关性疾病的治疗研究中。据此我们选择特异性a7nAChR激动剂PNU282987替代直接的迷走神经电刺激后处理,观察其对缺血-再灌注心肌的保护作用。本实验前期的在体研究已初步证实了我们的实验设想,即PNU282987后处理同直接迷走神经电刺激后处理一样,亦能通过抑制IRI过程中的炎症反应而显著减轻心肌组织损伤。但是关于PNU282987后处理心肌保护作用的量效关系以及其保护作用机制目前尚未阐明。 此网站 糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3p, GSK-3p)是真核生物中一种高度保守的多功能丝氨酸／苏氨酸激酶。研究证实激活GSK-3β是缺血-再灌注导致组织损伤的重要机制。活化后的GSK-3β通过放大炎症反应、开放线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)以及激活多条促凋亡途径加剧组织损伤。抑制GSK-3β活性是多种内源性和外源性心肌保护干预措施的共同机制靶点。所以我们推测GSK-3β极有可能是CAP中a7nAChR激动剂PNU282987后处理心肌保护作用的重要机制点。

mPTP过度开放导致线粒体膜电位不可逆性降低,并激活线粒体依赖性凋亡途径是心肌IRI的另一重要发生机制。采取各种措施抑制mPTP过度开放被证实能明显减轻心肌IRI。并且同炎症反应一样,mPTP亦受控于GSK-3p,那么炎症反应和mPTP开放状态在心肌IRI中的相互关系如何?明确这一点将有助于进一步明确a7nAChR激动剂PNU282987后处理的心肌保护作用机制,并且能更加全面的掌握心肌IRI的发生机制。 鉴于上述分析,我们设计了这个随机对照离体细胞实验,研究的主要目的包括：①构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。②在离体细胞层面观察α7nAChR激动剂PNU282987后处理的心肌保护作用并阐明其量效关系；③观察GSK-3β在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位；④探究mPTP与炎症反应在心肌IRI中的相互关系,以及两者在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位和相互关系。 第1部分新生鼠心肌细胞体外培养和离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型的建立 本部分实验的目的是建立成熟、稳定和高质量的心肌细胞体外培养方法,并在此基础上采用厌氧法构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧(anoxia/reoxygention)损伤模型。 采用0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶混合多次消化法分离1-2d SD新生鼠心肌细胞,1h差速贴壁结合5-BrdU化学抑制法纯化心肌细胞。倒置相差显微镜镜下观察细胞活性并通过心肌肌钙蛋白T(Cardiac

troponia T, cTnT)免疫荧光法复合细胞核4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine 不 dihydrochloride, DAPI)染色法鉴定心肌细胞纯度。 采用厌氧培养法构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。心肌细胞培养72h后,随机分为7组：Sham组(空白对照组),心肌细胞正常培养不进行任何处理；3h组,心肌细胞仅接受缺氧3h的处理；3h/6h组,心肌细胞接受缺氧3h和复氧6h的处理；6h组,心肌细胞仅接受缺氧6h的处理；6h/6h组,心肌细胞接受缺氧6h和复氧6h的处理；9h组,心肌细胞仅接受缺氧9h的处理；9h/6h组,心肌细胞接受缺氧9h和复氧6h的处理。实验结束后,采用专用的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,膜联蛋白V/碘化丙啶(propidine iodide, PI)(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况。 倒置相差显微镜下观察,心肌细胞活性高、收缩有力,48-72h出现同步化搏动,形成功能上的合胞体。cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定心肌细胞纯度达到(94.2+2.

7,从而探究该蛋白在NF-κB和MAPK信号通路中所发挥的调节作用,为进一步研究猪链球菌2型CcpA蛋白的免疫调节机制奠定基础。 本研究对猪链球菌2型CcpA蛋白进行原核表达并纯化后,刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,从而探究该蛋白在NF-κB和MAPK信号通路中所发挥的调节作用,为进一步研究猪链球菌2型CcpA蛋白的免疫调节机制奠定基础。 首先,本试验以SS2全基因组为模板,采用PCR方法扩增并克隆CcpA基因序列,连接至原核表达载体pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-CcpA,经Xho Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切及测序鉴定正确。将pET-28a-CcpA质粒转入感受态细胞Ecoil BL21中,通过对诱导条件的优化,最终经1mmol/LIPTG诱导6h后CcpA蛋白可较高水平表达,SDS-PAGE分析,可见约38kDa的蛋白表达。Western Fludarabine体外 blot鉴定,CcpA蛋白具有良好的反应原性,通过His TrapFF亲和层析柱对CcpA原核表达蛋白进行纯化。 其次,为探究CcpA蛋白可否激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的免疫应答反应,本试验以3、10、30μg/mL的CcpA纯化蛋白作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7,16h后检测巨噬细胞NO的分泌量与对照组相比显著增加,并随着CcpA蛋白浓度的提高NO的分泌量也随之增加。试验表明CcpA蛋白可激活巨噬细胞RAW264.7的免疫应答反应。

最后,为探究CcpA蛋白在小鼠巨噬细胞NF-κB和MAPK信号通路中所发挥的调节作用,本试验中采用30mg/mL的iNOS、NF-κB、p38和ERK1/2MAPK通路抑制剂对巨噬细胞进行预处理30mmin后,再用10μg/mL的CcpA纯化蛋白刺激巨噬细胞。检测发现：CcpA蛋白可通过iNOS、NF-κB、p38和ERK1/2MAPK通路影响巨噬细胞NO的分泌；另外,CcpA蛋白可经NF-κB和ERK1/2MAPK通路影响巨噬细胞IL-6的分泌；经NF-κB和ERK1/2MAPK通路影响巨噬细胞IFN-y的分泌；经p38和ERK1/2MAPK通路影响巨噬细胞TNF-α的分泌。 什么 综上所述,猪链球菌2型CcpA蛋白可激活小鼠巨噬细胞的免疫应答反应,并可经NF-κB和MAPK通路对小鼠巨噬细胞NO、IL-6、IFN-γ和TNF-α的分泌呈不同程度的影响。
背景：间充质干细胞是中胚层来源的多能干细胞,具有高度自我更新和多向分化潜能,不仅能在体外培养扩增,而且在特定条件下可以被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞等。它存在广泛,在全身多种组织中均可分离培养,是细胞替代治疗和组织工程的重要种子细胞,具有广阔的临床应用前景。在目前注册的临床试验中,间充质干细胞被应用于多种疾病,包括自身免疫性疾病、器官移植、慢性炎症及组织损伤等,并取得了较好的疗效。肿瘤是目前人类健康的主要威胁之一,以其高发病率及高死亡率引起极大的关注,成为研究的热点。目前研究显示,尽管肿瘤细胞自身及其相关基因突变在肿瘤的发病中起重要作用,其生存所需的肿瘤微环境对肿瘤的作用同样不可忽视。构成肿瘤微环境的成分非常复杂,间充质干细胞是其中重要的组成部分,因此,间充质干细胞与肿瘤的关系引起人们极大的兴趣,并进行了一系列的研究,但却出现了许多相互矛盾的结果,其中涉及到的机制,仍有待进一步的研究。

目的：脐带是间充质干细胞的重要来源,因其取材方便、传代能力强并且没有伦理学限制等特点,成为最具临床应用前景的间充质干细胞。本研究旨在观察人脐带间充质干细胞对急性髓细胞白血病细胞系HL-60的影响,尤其是其对化疗药物的敏感性的影响,并对涉及其中的机制进行探讨,为人脐带间充质干细胞在急性白血病患者中的应用提供一定的理论基础。 方法：(1)在诱导体系中,定向诱导人脐带间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化,用油红O染色、Von

Kossa染色观测脂滴形成、钙盐沉积情况以鉴定人脐带间充质干细胞的多向分化潜能。(2)应用流式细胞仪检测阿糖胞苷诱导的HL-60细胞单独培养及与人脐带间充质干细胞共培养时的凋亡情况。(3)应用流式细胞仪检测与人脐带间充质干细胞共培养对HL-60细胞细胞周期的影响。(4)应用Real-time PCR方法及Western Blot方法检测与人脐带间充质干细胞共培养对HL-60细胞中Caspase3的mRNA和蛋白水平表达情况的影响。(5)应用transwell细胞共培养体系研究人脐带间充质干细胞发挥作用的机制。(6)在共培养体系中加入信号通路阻断剂,观测阻断信号通路对人脐带间充质干细胞保护作用的影响。 LDN-193189订单 结果：(1)分离出的人脐带来源间充质干细胞具有多向分化能力。(2)阿糖胞苷可以诱导HL-60细胞凋亡,且具有时间-剂量依赖性。人脐带间充质干细胞可以减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡,与细胞之间的比例没有太大关系。(3)与人脐带间充质干细胞共培养可以将HL-60细胞阻滞在G0/G1期,阻止其进入S期。(4)人脐带间充质干细胞可以降低阿糖胞苷诱导的HI-60细胞内凋亡蛋白Caspase3的mRNA和蛋白水平的表达。(5)在transwell培养体系中,人脐带间充质干细胞同样可以减少阿糖胞苷诱导的HI-60细胞凋亡。(6)PI3K/Akt信号通路参与到人脐带间充质干细胞的保护作用,当使用信号通路阻断剂处理时,可以部分逆转人脐带间充质干细胞的作用。 结论：人脐带间充质干细胞通过分泌可溶性细胞因子减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡。其机制可能与通过调节HL-60细胞周期及下调Caspase3表达相关。PI3K/Akt信号通路参与这种保护作用。
基于磷钨酸所表现出的酸性和氧化性，其既可以作为酸性催化剂，又可以作为氧化催化剂，同时它还表现出了多功能协同催化的特点。因此，我们在磷钨酸的催化下进行了含氮杂环衍生物的绿色合成研究。 基于磷钨酸特殊的空间结构所表现出来的多功能协同催化性能，我们首先研究了使用磷钨酸/四叔丁基溴化铵催化双氧水氧化苯甲醛和乙二胺反应合成2-苯基咪唑啉。系统考察了催化氧化体系、反应温度、反应溶剂、反应时间和催化剂用量等对此反应的影响。结果显示，在最优条件下2-苯基咪唑啉的收率可以达到93.

用转录抑制剂放线菌素d预处理人血管内皮细胞,再以尿酸进行干预,应用real-timepcr在不同时间点检测enosmrna表达水平,以判断尿酸对rna稳定性的影响。3.用enos特异性抑制剂l-name预处理人血管内皮细胞,再用尿酸进行干预,mtt方法检测内皮细胞增殖情况,以判断尿酸对内皮细胞增殖的影响是否直接与enos有关。4.用westernblot方法分别检测不同时间点(10min,20min,30min,40min)经尿酸作用的人血管内皮细胞mapks(p38mapk,jnkmapk,erkmapk)通道是否有激活,判断不同血管内皮细胞是否被激活的mapks通道种类及激活时间不同。5.应用p38mapk通道特异性药物抑制剂(sb203580)预处理人冠状动脉血管内皮细胞,然后加入尿酸,通过real-timepcr的方法检测enosmrna表达水平变化,判断尿酸对enosmrna表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。应用腺病毒负性突变体p38-dn-adv转染人冠状动脉血管内皮细胞后再加入尿酸,通过westernblot方法检测enos蛋白表达水平的变化,判断尿酸对enos蛋白表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。6.pgl2-enos(-331/+109)-fireflyluciferasereporter质粒和pgl2-β-actin-renillaluciferase共转染hcaec细胞后,加入600umol/l尿酸继续培养,双荧光报告基因系统检测尿酸是否影响enos启动子的活性,判断尿酸是否在转录前水平调节enos基因表达。7.用染色质免疫共沉淀技术检测转录因子gata-4与enos启动子的结合情况,以判断尿酸是否对该结合状况有影响。8.通过大鼠腹腔动脉血管环实验检测尿酸对动脉血管舒张功能的影响,并进行统计学分析。三、cyp11b2-344t>c基因多态性与高血压病心房颤动发生的相关性1.通过病例-对照研究进行meta分析,探讨cyp11b2-344t>c基因多态性和心房颤动易感性的关系。2.应用统计软件计算等位基因模型,纯合子模型,隐性模型和显性模型的优势比(or)和95%可信区间(ci),并通过固定效应和随机效应模型评估二者的关联性。3.根据异质性来源的不同进行亚组分析,最后达到应用单一原因对于总体结果进行评价,并对文章的发表偏倚进行评估。研究结果:1.研究发现高血压病患者血尿酸水平升高与心房颤动的发生密切相关(1)本研究共纳入940例患者,其中高血压病合并心房颤动患者362例,高血压病不合并心房颤动患者578例(对照组)。两组患者的性别、白细胞值、血钾值、肌酐值、收缩压、舒张压、左心室后壁厚度及室间隔厚度与心房颤动发生的风险均无统计学差异(p>0.05)。与对照组比较,高血压病合并心房颤动组平均年龄更大(67.13±10.59vs.56.78±14.92,p<0.01)、患高血压病平均时间更长(9.27±9.50vs.3.85±3.57,p<0.01),且血尿酸水平及左心房直径明显高于对照组,分别为388.11±112.51vs.311.54±122.51(p<0.01)及45.79±7.56vs.34.08±4.36(p0.05)和52.88%(p<0.01)。(8)染色质免疫共沉淀技术检测与对照组相比,尿酸使转录因子gata-4与hcaec细胞启动子的结合力增强。(9)在内皮依赖型缓激肽作用下,对照组大鼠离体腹腔主动脉血管环发生舒张。作为阴性对照组的l-name组动脉血管环舒张幅度明显减弱,和对照组相比,尿酸组动脉血管环的舒张幅度减弱48.53%(pc多态性明显与心房颤动易感性显著相关(等位基因模型:or=1.18,95%ci=1.04-1.33,pC基因多态性与心房颤动易感性存在显著的相关性。丰富了对心房颤动发病因素的认识,4.通过心房颤动病因方面的认识,可以从控制体内尿酸值的角度预防高血压病患者心房颤动的发生,为临床防治高血压病心房颤动的发生提供了新的思路。
在哺乳动物免疫系统中,白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)被认为是具有多重功能的重要细胞因子。IL-10由多种细胞分泌并作用于各种免疫细胞,如T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞,调控这些细胞的生长、成熟、增殖、分化与活化,进而影响机体的天然免疫和获得性免疫,并与其它细胞因子一起维持了免疫系统的稳定。硬骨鱼IL-10在多种鱼类包括斑马鱼、金鱼、鲤鱼和虹鳟中被克隆鉴定,但有关硬骨鱼IL-10的免疫调节功能知之甚少,其受体和细胞信号传导途径,以及作用机制均有待阐明。本论文研究草鱼IL-10的免疫学功能,不仅揭示其保守的抑炎症功能,而且阐明它和另一经典抑炎症细胞因子TGF-β1参与免疫反应调节的相互关系和作用机制,从而拓展了对鱼类IL-10免疫学地位的认识。另外,为了解草鱼IL-10发挥作用的分子机制,进一步鉴定了草鱼IL-10介导的IL-10受体1(IL-10R1)和IL-10受体2(IL-10R2)及其下游信号通路(STAT3)和靶基因细胞因子信号转导负调控蛋白3(Suppressor

Doxorubicin 还有 点击此处 of cytokine signaling 3,SOCS3)。为获悉草鱼IL-10的产生机制,初步探讨了LPS和IFN-γ对草鱼IL-10的转录调控机制。具体研究内容如下:1.

aureus乳腺炎的感染损伤机制还不清楚,因此探索S.aureus乳腺炎发生、发展与转归的分子机制迫在眉睫。 中性粒细胞是奶牛乳腺抵御病原菌侵袭的第一道防线,它的凋亡对于控制乳腺炎症的发展和转归至关重要,在解除奶牛不良炎性反应中发挥重要作用。 为了探索奶牛S.aureus乳腺炎发生时中性粒细胞凋亡的分子机制,找到调控中性粒细胞凋亡的相关基因,本实验在体外37℃,5%C02的条件下培养从奶牛外周血中分离到的中性粒细胞,向培养基中以50：1的比例加入处于对数生长期的S.aureus,分别在共培养Oh,2h,4h,6h,8h,10h后用PITC/PI双染法通过流式细胞术检测中性粒细胞凋亡情况。最后利用基因芯片技术筛选出与中性粒细胞凋亡相关的基因,并通过qPCR对芯片结果加以验证。实验所得结果有以下几个方面：

1、中性粒细胞体外培养存活情况 体外培养的中性粒细胞的活细胞比例随着培养时间的延长不断下降,培养Oh时为100%,培养10h后活细胞比例降为80%,培养28h后降至50%。 2、S.aureus诱导中性粒细胞凋亡情况 在第Oh,2h,4h,6h,8h和10h检测中性粒细胞凋亡,实验组细胞凋亡率相比于对照组均存在极显著差异,差异值分别为3.31%,4.63%,6.77%,8.83%,8.12%和6.35%,其中诱导时间为6h时凋亡率差异最大。 3、基因芯片结果 与凋亡相关的差异表达基因共有4个,其中上调表达的为Bcl-2,它的上调表达倍数为2.4847；下调表达的有IL1-α, GW786034半抑制浓度 IL1-β和IL1-R1,下调表达倍数分别为0.2125,0.2062和0.3082。 4、qPCR验证结果 qPCR结果与芯片结果一致的有ILl-α, ILl-β和IL1-R1三个基因,而Bcl-2与芯片结果相左,表现为下调表达。 通过以上结果能得到如下结论： 1、中性粒细胞在体外环境下能够自发凋亡,存活时间较短； 2、S.aureus能够诱导体外培养的中性粒细胞凋亡,而且在10h的诱导时间内凋亡率的变化是极显著的； 3、调控中性粒细胞凋亡的基因主要为原癌基因Bcl-2, IL1及其受体。 4、芯片结果比较可信。
本研究通过建立亚急性镉染毒诱导小鼠模型,运用HE染色、透射电镜、免疫组化和Western blotting等技术方法,研究了雷帕霉素在抗镉诱导小鼠脑神经细胞氧化应激和凋亡中的保护作用,探讨雷帕霉素抑制镉诱导小鼠脑组织mTOR通路激活抗凋亡机理,为雷帕霉素在防止镉诱导的神经变性疾病提供理论依据和科学指导。结果如下： 1雷帕霉素抑制镉诱导小鼠脑神经细胞氧化应激发挥抗凋亡保护作用 36只成年健康ICR雄性小鼠,实验分为对照组(0.9%生理盐水)、雷帕霉素处理组(按7.5mg/kg体重)、2个CdCl2处理组(分别按0.5和1mg/kg体重)、2个雷帕霉素与CdCl2联合处理组,共6组。实验给药采用腹腔注射方式,实验周期11天。HE染色和透射电镜分别观察脑组织学和超微结构变化,生化分析脑组织ROS、GSH、CAT水平变化,TUNEL染色评价脑神经细胞凋亡状态。结果显示：镉染毒小鼠脑颞叶皮层出现明显的混乱,海马区细胞排列松散,脑神经元线粒体肿胀和内嵴的断裂,而雷帕霉素能够明显削弱和保护这种改变。镉诱发脑组织ROS升高以及GSH含量和CAT活性降低,这被雷帕霉素明显改善。镉诱导大脑皮层和海马组织TUNEL阳性神经细胞数量增加也被雷帕霉素显著抑制。提示雷帕霉素可以通过抑制镉诱导小鼠脑组织神经细胞氧化应激发挥抗凋亡保护作用。

GSK-3 cancer 2雷帕霉素抑制镉诱导小鼠脑组织mTOR通路激活发挥抗凋亡保护作用 36只成年健康ICR雄性小鼠,实验分为对照组(0.9%生理盐水)、雷帕霉素处理组(按7.5mg/kg体重)、2个CdCl2处理组(分别按0.5和1mg/kg体重)、2个雷帕霉素与CdCl2联合处理组,共6组。实验给药采用腹腔注射方式,实验周期11天。免疫组化分析4E-BP1磷酸化表现,Western blot分析Akt、S6K1、4E-BP1和caspase-3蛋白表达。结果显示：免疫组化分析显示,镉染毒小鼠大脑皮层及海马CA1区磷酸化4E-BP1(Thr70)阳性细胞数量明显增加,Western PD0325901溶解度 blot分析展示镉诱导脑组织Akt、mTOR介导的S6K1和4E-BP1磷酸化以及cleaved-caspase-3增加,雷帕霉素明显地抑制这些信号分子改变。提示：雷帕霉素通过抑制镉诱导小鼠脑组织mTOR通路激活发挥抗凋亡保护作用。
内毒素休克(endotoxic shock)是临床危重病中常见的症状,可造成多器官损伤,其中以急性肺损伤(acute lung injury; ALI)常见,进一步可导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory

distress syndrome; ARDS)。内毒素休克所致肺损伤其发病机制复杂,治疗棘手,探讨其发病机制并进行合理有效地治疗仍是国内外研究的热点。 我们的前期研究结果表明,血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)在内毒素休克肺损伤时表达增多,可对肺起到一定的保护作用,明确其调节机制对临床制定预防措施具有重要意义。P38MAPK和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases, ERK1/2)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein kinase, MAPK)通路中的重要通路之一,是生物体内重要的信号转导分子,在细胞分化、凋亡及炎症等过程中起重要作用。有研究表明,人肾癌细胞内ERK的激活能诱导HO-1表达增多并抵抗细胞凋亡[2],也有研究发现,体外培养的血管平滑肌细胞内受到外界刺激时,可通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路诱导HO-1表达上调。至于P38MAPK和ERKl/2信号通路是否介导内毒素休克大鼠受损肺脏HO-1的表达,目前尚未见报道。本课题拟通过建立大鼠内毒素休克肺损伤模型并给予P38MAPK和ERK1/2通路的抑制剂来探讨P38MAPK和ERK1/2信号通路对内毒素休克大鼠受损肺脏内HO-1表达的影响。 第一部分：P38MAPK信号通路在内毒素休克诱发急性肺损伤大鼠肺组织中HO-1表达过程中的作用 目的探讨P38MAPK信号通路在内毒休克诱发急性肺损伤大鼠肺组织中HO-1表达过程中的作用。 方法清洁级雄性SD大鼠48只,体重180g～200g,采用随机数字表法,随机分为4组(每组12只)：对照组(C组)、内毒素休克组(LS组)、内毒素休克+抑制剂组(LSS组)和抑制剂组(B组)。C组和LS组股静脉输注0.1m1DMSO(二甲亚砜),LSS组和B组股静脉P38MAPK阻断剂SB2O35805μmol/kg(溶于0.1m110%二甲基亚砜)；30min后,C组和B组分别给予0.5ml生理盐水,LS组和LSS组分别给予LPS(脂多糖)10mg/kg(溶于0.

SDF-1β的剂量效应实验证明其在100 nM时能够显著抑制Pal诱导的心肌细胞凋亡。 6. SDF-1β预防Pal诱导心肌细胞凋亡的作用是通过激活p38 MAPK实现的,用p38阻滞剂SB203580能够完全阻断SDF-1β的心肌保护作用。p38βsiRNA同样能够完全抑制SDF-1β的心肌保护作用,进而说明SDF-1β预防心肌细胞凋亡的作用是通过激活p38β亚型实现的。 OSI-744临床试验 7. SDF-1β的心肌保护作用是通过激活AMPK实现的,SDF-1β激活p38 MAPK的作用是AMPK依赖性的,AMPK阻滞剂compound C能够阻断SDF-1β的保护作用,而AMPK激动剂AICAR同SDF-1β一样,能够预防Pal引起的心肌细胞凋亡。 8. SDF-1β能够促进H9c2细胞分泌IL-6进而保护Pal诱导的细胞凋亡,这种效应是通过激活AMPK及p38 MAPK实现的。 9. IL-6 siRNA能够阻断SDF-1β的心肌保护作用,而重组IL-6能够预防Pal诱导的H9c2细胞凋亡。 10. H9c2细胞表面存在CXCR7受体,SDF-1β保护Pal诱导心肌细胞凋亡的作用不是通过其细胞表面受体CXCR4、而是通过CXCR7实现的。这种效应能够被CXCR7 siRNA所阻断,同时,CXCR7 siRNA还能够阻断SDF-1β对AMPK及p38 MAPK的激活作用。 结论: 1. Pal引起H9c2细胞凋亡是通过诱导细胞硝化损伤和ERS实现的;凋亡的发生是ERS依赖性的,而ERS的发生是硝化损伤依赖性的。 2. SDF-1β能够预防Pal引起的心肌细胞硝化损伤、ERS和凋亡。

3. SDF-1β的心肌保护作用是通过与细胞表面受体CXCR7结合,进而激活AMPK和p38 MAPK,促进IL-6生成来实现的。 创新点: 1.阐明Pal诱导心肌细胞凋亡的分子机制,即Pal通过诱导细胞硝化损伤和ERS进而引起心肌细胞凋亡。 2.证明SDF-1β对Pal诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。 3.证明H9c2细胞表面有CXCR7表达。 4.阐明SDF-1β预防Pal诱导心肌细胞凋亡的分子机制,即通过与CXCR7结合,进而激活AMPK和p38 MAPK,促进IL-6生成来实现的。
应激性是生物体的普遍特性。应激(Stress)是指机体受到各种应激原刺激时出现的以交感神经兴奋性增高和下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA axis)过度激活为主的一系列神经内分泌反应。HPA轴持续反复激活导致其终末靶腺肾上腺皮质分泌过多的GC,是应激反应的最重要特征。海马对应激反应有整合作用,对GC的分泌起非常重要的调节作用,是HPA轴应激反应的高位调节中枢,是慢性应激损伤的敏感区。生理剂量的GC对机体有益,而过量的GC则对机体有害,特别是对海马神经元产生不良作用。细胞凋亡是GC导致海马神经元损伤的其中最主要机制之一。已有研究表明,淫羊藿具有改善学习记忆功能及抑制神经细胞凋亡的作用。但淫羊藿苷对皮质酮所致海马神经元损伤保护作用的具体机制尚未见报道。

Dolutegravir 研究目的:探讨淫羊藿苷对皮质酮诱导的大鼠原代培养海马神经元损伤保护作用的可能机制。 研究方法: 1.采用新生24h以内Sprague-Dawley大鼠原代培养海马神经元。 2.采用MTT法和LDH释放法观察皮质酮诱导的原代培养海马神经元的存活率以及淫羊藿苷干预后的影响。 3.采用Hochest33258、TUNEL原位荧光染色、线粒体跨膜电位以及caspase-3分光光度法检测淫羊藿苷干预后对原代培养海马神经元凋亡的影响。 4.采用荧光分光光度法利用Fura 2-AM荧光探针检测淫羊藿苷干预后海马神经元胞内游离钙离子浓度的变化。 5.采用DCFH-DA荧光探针检测淫羊藿苷干预皮质酮诱导的海马神经元活性氧的水平并检测细胞内总SOD的含量。 6.采用Western blot蛋白检测方法探索淫羊藿苷神经保护作用的可能作用信号转导通路MAPK和PI3K/Akt。

研究结果: 1.1形态学结果显示,1uM和10uM浓度的CORT对海马神经元的作用较明显,其突触、包膜和胞核均有不同程度的损伤,表现为突起断裂,包膜不完整,胞体膨胀,胞核固缩,而10nM、50 nM、100 nM几乎对神经元无作用。淫羊藿苷能够逆转这种损伤作用。 2.2 MTT法和LDH法结果显示,1uM和10uM浓度的CORT作用于原代培养海马神经元24h后,其细胞存活率分别为58.1%和44.7%,作用于48h后分别下降为46.3%和16.8%,至72h后,其细胞存活率均接近15%,且呈浓度和时间依赖性下降,用10~(-5)-10~(-6)mmol/L三个浓度的淫羊藿苷预处理2h,然后和1uM的皮质酮共孵育24h,发现淫羊藿苷能明显减少皮质酮干预后的神经元的损伤,与对照组相比有显著性差异(p＜0.01),但三个剂量之间无明显差异。SB203580是MAPK通路中p38 MAPK特异性阻断剂,LY294002是PI3K/Akt信号转导通路中PI3K的抑制剂,采用这两个阻断剂分别特异性阻断这两条信号转导通路,则淫羊藿苷的保护作用被抵消。 3.3 Hochest33258,TUNEL原位荧光染色、线粒体跨膜电位以及caspase-3检测结果显示,大鼠海马神经元暴露于1uM皮质酮24h后出现明显的核浓缩和胞体膨胀,而正常对照组则表现为圆形的细胞核形态。给与10-6 mmol/L淫羊藿苷干预后,与模型组比较,核固缩的神经元比例大幅降低。皮质酮干预海马神经元24h后,经TUNEL法检测可见较多的凋亡阳性细胞,数个成群分布,表现为细胞核红色着染、核染色质浓缩与边移等凋亡细胞的形态特征。而正常组只有较少的红染得凋亡阳性细胞。用淫羊藿苷干预后,细胞核红染的凋亡阳性细胞比例减少,提示淫羊藿苷能够抑制皮质酮所致的海马神经元凋亡。用Rhodamine123荧光探针检测神经元内线粒体跨膜电位,染色结果显示,正常对照组几乎见不到绿色荧光,而皮质酮干预组绿色荧光非常强,淫羊藿干预后,绿色荧光减弱。caspase-3检测结果显示,模型组较空白对照组caspase-3的OD值明显升高,有统计学意义(P＜0.01);淫羊藿处理后其OD值和相对活性有极显著的降低(P＜0.01)。 http://www.selleck.cn/products/BafilomycinA1.html 4.本研究发现1uM皮质酮作用于海马神经元24h后,其胞内钙荧光强度较空白对照组明显升高,统计学上有显著性差异(P＜0.01),用10~(-6)mmol/L淫羊藿苷干预后能显著抑制有皮质酮引起的海马神经元胞内游离钙离子浓度的异常升高,统计学上有显著性差异(P＜0.05)。 5.在本研究中我们采用DCFH-DA荧光探针进行活性氧的检测,同时检测神经元总SOD,结果显示,皮质酮干预海马神经元后,表现为绿色荧光增强,提示神经元活性氧水平升高,但淫羊藿苷干预后无变化。同时,总SOD结果也显示,淫羊藿对皮质酮所致的海马神经元总SOD下降无逆转效应。表明淫羊藿苷的保护作用可能与氧化应激无关。 6.

7%、63.3%、71.3%)明显高于癌旁组织(31.3%、14.0%、11.3%)及正常肺组织(35.7%、14.3%、7.1%),差异具有显著性(p<0.01),并与患者的临床分级,病理分化,有无淋巴结转移密切相关；生存期分析结果表明EzrinThr-567的异常表达与NSCLC的生存期密切相关(p<0.05),而在早期NSCLC中Ezrin与EzrinThr-567均与生存期密切相关(p
研究背景

几个世纪以来,科学家们一直在寻求治愈肿瘤的方法,随着对抗肿瘤作用机理研究的深入,抗肿瘤新药不断涌现。然而,在肿瘤的治疗中一个很大的障碍是肿瘤细胞的多药耐药,最终导致了肿瘤化疗的效果不佳甚至失败。ABC (ATP-binding cassette)跨膜转运蛋白超家族在肿瘤的耐药过程中起着很大的作用,影响着肿瘤细胞对不同药物的吸收、分布、代谢和排出。这些ABC跨膜转运蛋白超家族在肿瘤细胞常常高表达,与抗癌药物相结合,利用ATP水解释放能量促使药物被泵到胞外,从而导致肿瘤细胞产生耐药性。由于ABC跨膜转运蛋白超家族的这一特点,学者们开始致力于寻找能够有效抑制ABC跨膜转运蛋白家族的抑制剂。 近年来,一些酪氨酸激酶抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂等被发现能够逆转ABC跨膜转运蛋白介导的多药耐药。Tivozanib(AV-951, Quisinostat KRN-951)是一种新型的酪氨酸激酶抑制剂,能够抑制血管内皮生长因子1、2、3。由于很多酪氨酸激酶抑制剂同时为ABCB1和ABCG2的逆转剂,本研究主要探索tivozanib与ABC跨膜转运蛋白之间的作用关系及其相关机制。

研究目的 1.检测tivozanib的细胞毒性作用； 2.研究tivozanib是否能够逆转ABC跨膜转运蛋白介导的多药耐药； 为什么 3.探讨tivozanib逆转肿瘤细胞多药耐药的机制。研究方法 1.实验中用到的细胞株包括人口腔上皮鳞癌细胞KB-3-1和用秋水仙碱诱导KB-3-1产生的耐药细胞株KB-C2；人胚肾HEK293细胞转染空载pcDNA3.1构建的HEK293/pcDNA3.1、转染ABCB1构建的HEK/ABCB1以及过表达ABCG2的转染细胞株ABCG2-482-R2.ABCG2-482-G2、ABCG2-482-T7。 2.MTT方法用于检测tivozanib在不同细胞株中的毒性,以及tivozanib对于耐药细胞株耐药倍数的影响。 Protein Tyrosine激酶抑制剂 3.Western Blotting用于检测细胞中ABCB1、ABCG2分子的表达,分析tivozanib对于ABC跨膜蛋白表达的影响。

4.Accumulation assay用于检测放射元素标记的ABCB1作用底物[3H]-paclitacel和ABCG2作用底物[3H]-mitoxantrone在细胞内的积累情况。 5.Efflux assay用于检测细胞在不同时间点对于ABCB1作用底物[3H]-paclitaxel和ABCG2作用底物[3H]-mitoxantrone的外泵作用。 6.[125I]Iodoarylazidoprazosin(IAAP)-photoaffinity labeling探讨tivozanib与ABCB1和ABCG2的作用位点。 7.ATPase assay用于测定tivozanib对于ABCB1和ABCG2的ATP酶活性的影响。 研究结果 1.Tivozanib在浓度小于6μM时对于实验中所涉及的细胞株无明显细胞毒性。 2.Tivozanib在2.5μM和5μM的浓度时能够逆转ABCB1和ABCG2介导的多药耐药。MTT结果显示tivozanib在特定浓度能够显著降低耐药细胞株对于ABCB1转运底物紫杉醇、秋水仙碱和长春新碱的耐药性,以及ABCG2过表达细胞株对于ABCG2转运底物底物米托蒽醌、SN-38和多柔比星的耐药性。 3.Western blotting表明tivozanib抑制ABCB1、ABCG2的功能不是通过下调其蛋白表达来实现的。 4.Efflux assay和accumulation assay的结果证实tivozanib是通过抑制ABCB1和ABCG2转运蛋白的活性,进而增加细胞内化疗药物的积累来发挥逆转多药耐药的功能。 5.[125I]IAAP-photoaffinity labeling提示tivozanib能够与IAAP竞争与跨膜转运蛋白ABCB1、ABCG2的结合区域,说明tivozanib是通过直接结合于ABCB1、ABCG2转运蛋白的底物结合位点来发挥作用的。 6. ATPase试验表明tivozanib能够通过调节ABCB1和ABCG2结构域中ATP水解酶的活性,来抑制ABCB1和ABCG2介导的多药耐药。 结论 1. Tivozanib在特定浓度能够逆转ABCB1、ABCG2跨膜转运蛋白介导的多药耐药。 2.

pylori、COX-2、CA724和GRN的表达上调。 (iii)在胃癌中,H. pylori的表达和LeY、COX-2、CA724及GRN的表达相关。 (iv)塞来昔布抑制FUT1、FUT4和LeY的表达。 (v)LeY调节H. pylori的毒性。 (vi)联合使用塞来昔布和LeY寡糖抗体处理细胞,能抑制胃癌细胞的增殖。 3.Rg3对胃癌细胞凋亡的作用机制的研究 (i)Rg3通过激活caspase-3,-8,-9及PARP的裂解促进胃癌细胞凋亡。 (ii)在胃癌细胞中,Rg3下调FUT4的表达。 (ⅲ) CagA调节SP1和HSF1的表达。 (iv)Rg3调节SP1和HSF1的表达。 (v)SP1和HSF1调节FUT4的表达。 V.结论 1.胃癌中CagA、pEGFR、FUT4和LeY的表达升高；CagA通过EGFR/MAPKs信号通路促进FUT4和LeY的表达。 Compound C数据表 2.LeY抗体增加塞来昔布的抗肿瘤作用；LeY抗体和塞来昔布通过抑制COX-2和LeY的表达及其介导的MAPKs/COX-2信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。

3.Rg3通过调节SP1和HSF1的表达而下调FUT4的表达,达到治疗肿瘤的效果。 4. FUT4/LeY、COX-2/LeY和SP1/HSF1可能是胃癌的潜在治疗靶点。
目的 宫血宁胶囊（GXN）是利用云南省道地中药材重楼开发的总甾体皂苷（TSSPs）制剂，目前已成为国内妇科专家首推的治疗妇科血症的中成药制剂。在既往的研究中我们已经发现GXN能够增强子宫收缩和促凝血功能是治疗异常子宫出血（AUB）的两个关键药效学基础，并通过植化研究鉴定出十余种甾体皂苷，进行构效关系分析确定了具有螺甾结构的偏诺类皂苷具有显著的促子宫平滑肌收缩活性，并且研究证实了单体Tg引起大鼠血小板聚集、促进凝血的信号转导通路。然而，甾体皂苷引起子宫平滑肌收缩的药理学作用，尤其是作用的信号转导通路尚不十分清楚。本研究的目的在于探索中药甾体皂苷诱导子宫平滑肌收缩的信号转导通路，明确甾体皂苷缩宫作用机制，为寻找作用靶点以及药物的二次开发提供理论依据。

点击此处 内容 明确偏诺皂苷Tg诱导的大鼠子宫平滑肌收缩与MLC20磷酸化的关系；探讨PLC-IP3、RhoA/ROK、ERK/MAPK、P38/MAPK、JNK/SAPK和PKC等可能通路的参与与否以及通路间的相互作用；构画Tg引起子宫平滑肌收缩的分子机制图。 方法 选用120~140g的雌性SD大鼠、采用组织块贴壁法进行原代大鼠子宫平滑肌细胞的分离和培养；利用离体子宫平滑肌收缩实验研究Tg的体外效应和各种抑制剂对Tg作用的影响；采用蛋白免疫印迹（Western blotting）技术检测可能涉及的信号通路中信号蛋白肌球蛋白轻链（MLC20）、ERK、p38、JNK和钙调结合蛋白（CaD）的磷酸化改变；利用细胞内钙离子标记、激光共聚焦检测平滑肌细胞内钙离子浓度的变化。 结果 1. Tg引起子宫平滑肌收缩效应的确定以及收缩与MLC20磷酸化效应的关系 从总甾体皂苷（TSSPs）中分离提取的单体化合物Tg具有显著的促子宫平滑肌收缩作用，作用的起始浓度为1.25μM，随着给药浓度的增加，收缩效应逐渐增强。已知生理状态下平滑肌细胞内p-MLC20表达水平与平滑肌收缩密切相关，为了揭示Tg诱导的大鼠子宫平滑肌收缩作用是否与平滑肌细胞内MLC20磷酸化关联，采用western blotting技术评价Tg刺激后胞内MLC20磷酸化水平的改变，发现Tg能够呈剂量和时间依赖性诱导组织细胞内p-MLC20表达水平的升高。MLC20磷酸化反应通常由MLCK介导，应用MLCK特异性抑制剂ML-7能够显著抑制Tg诱导的MLC20磷酸化以及子宫平滑肌收缩。而MLCK主要通过活化的CaM来激活，应用CaM特异性抑制剂W-7也能显著抑制Tg诱导的p-MLC20水平升高及子宫平滑肌收缩效应。 2.平滑肌细胞[Ca2+]i对MLC20磷酸化和Tg缩宫作用的影响 为了验证[Ca2+]i在Tg引起子宫平滑肌收缩以及MLC20磷酸化效应中的角色，研究首先从检测[Ca2+]i水平的改变入手。以2.5μM Tg刺激预先以Fluo4-AM共孵育的子宫平滑肌细胞，激光共聚焦显微镜下可见Tg刺激后，细胞内荧光强度显著性增高，作用12s出现荧光强度的峰值，持续1-2s后很快下降，提示Tg能够刺激子宫平滑肌细胞内[Ca2+]i瞬时升高，形成“钙振荡”。去除细胞外钙或利用L型钙离子通道阻断剂尼群地平以阻断外钙内流，或利用thapsigargin内钙耗竭剂阻断内钙释放，都能显著抑制Tg诱导的子宫平滑肌收缩以及p-MLC20水平的升高。应用PLC/IP3信号通路的特异性抑制剂几乎完全抑制Tg的缩宫作用以及p-MLC20水平升高。另外，Rethunium

Gefitinib研究购买 Red（兰尼碱受体（RYR）的特异性阻滞剂）能够阻止钙离子与受体的结合，从而抑制Ca2+引发的Ca2+释放（CICR），应用54μM Rethunium Red能抑制Tg缩宫作用的发挥。 3. RhoA/ROK信号通路在Tg缩宫机制中的调节作用 RhoA/ROK信号通路的激活可以通过使MLCP失活而提高p-MLC20浓度。应用ROK特异性抑制剂Y27632的既能够抑制Tg引起的子宫平滑肌收缩，也能抑制平滑肌细胞内p-MLC20升高。 4. ERK/MAPK信号通路在Tg诱导的子宫平滑肌收缩中的调节作用 MEK特异性抑制剂U0126能够抑制Tg诱导的子宫平滑肌收缩，主要表现为收缩频率的降低；并且，Tg呈剂量和时间依赖地引起子宫平滑肌细胞内ERK1/2磷酸化水平的升高，这一效应能够被U0126完全抑制；Tg还能引起CaD的磷酸化效应增强，可以被U0126部分抑制。为了验证ERK/MAPK通路的激活是否由ras/raf途径介导，检测raf蛋白的表达发现Tg尚能够引起平滑肌细胞内p-c-Raf表达的升高，具有时间依赖性；而应用ras阻断剂可以抑制Tg诱导p-ERK1/2升高。 5. p38/MAPK和JNK/SAPK信号通路在Tg诱导的子宫平滑肌收缩中的调节作用 已有研究表明在其他平滑肌组织中p38/MAPK和JNK/SAPK信号通路参与收缩调节。我们的研究提示，Tg能够诱导子宫平滑肌细胞内p-p38和p-JNK水平的升高，效应具有时间和剂量依赖性。此外，在Tg引起子宫平滑肌收缩后给予p38通路抑制剂SB203580或JNK抑制剂SB600125均能抑制Tg的促收缩效应以及CaD磷酸化效应。 6.参与调节Tg引起子宫平滑肌收缩的信号通路间相互交叉 通过各种抑制剂的应用，发现ras/raf/ERK/MAPK信号通路不仅能够引起ERK1/2磷酸化，同时也能促进p-MLC20的产生；引起p-MLC20升高的PLC/IP3信号通路的激活也能引起p-ERK1/2表达水平的升高，而给予CaM抑制剂W-7和MLCK抑制剂ML-7对Tg的促ERK1/2磷酸化效应几乎无影响；0.

05）。 6.接受TKI治疗的患者共有38例，血浆EGFR突变者的疾病控制率（DCR）和客观缓解率（ORR）分别为90%（9/10）和60%（6/10），EGFR野生型患者的DCR和ORR分别为（53.57%，15/28）和（17.86%，5/28）。血浆EGFR基因是否突变，与TKI治疗疗效有关（DCR，P=0.059；ORR，P=0.019）。 7.接受TKI治疗的患者中，血浆KRAS野生型患者的DCR和ORR（66.67%，22/33；33.33%，11/33）高于KRAS突变患者（40%，2/5；0%，0/5）。但统计学差异不明显（DCR，P=0.337；ORR，P=0.295）。 8.接受TKI治疗的患者，总体中位PFS为6个月，EGFR基因19和21外显子突变的患者中位PFS为10.5个月，较EGFR野生型患者的中位PFS（5.1个月）显著延长，但统计学意义不明显（P=0.228）。KRAS突变的患者病情进展较快，其中位PFS仅为2.5个月，明显小于KRAS野生型患者的PFS（9个月），两组患者PFS具有显著统计学差异（P=0）。

结论： 1、晚期NSCLC血浆和组织中EGFR和KRAS基因突变具有高度的一致性，血浆样本可以作为组织样本的良好替代。 获悉更多 2、焦磷酸测序技术具有操作简便、高通量检测的特点，与ME-PCR的结合可有效富集突变型EGFR基因，可以准确检测出血浆EGFR和KRAS基因突变，可用于筛选适合TKI治疗的NSCLC患者，有利于指导NSCLC患者的个体化用药。 3、晚期NSCLC组织中EGFR突变更多见于不吸烟的女性腺癌患者。组织中KRAS突变、血浆中EGFR及KRAS突变与临床病理特征间无显著统计学差异。 4、血浆EGFR突变是TKI治疗的敏感性指标，其PFS较长；血浆KRAS突变则预示患者预后较差，PFS较短，表明血浆EGFR和KRAS突变可以较好的预测晚期NSCLC患者TKI治疗的疗效和预后。
恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，其发病率逐年升高，因此抗肿瘤药物的研究一直被全世界所密切关注。近年来，随着分子生物学技术的发展和对发病机制从细胞水平、分子水平的进一步认识，以肿瘤发生发展信号通路中的关键酶为靶点，发现高效低毒的抗癌药物已经成为重要的研究方向。分子靶向治疗是通过靶向于特异性通路的治疗策略，可有效阻止肿瘤细胞的生长并降低对正常细胞的毒性。 蛋白酪氨酸激酶（PTK）与肿瘤信号转导的密切关系，被广泛地作为抗肿瘤药物的靶点。在各种受体酪氨酸激酶中，肝细胞生长因子受体（c-met）对促进细胞生长、降低细胞凋亡、改变细胞骨架功能、增加转移和其他生物学改变起关键作用。因此，靶向于HGF/c-met通路可改善依赖c-met的肿瘤的治疗。 本文根据小分子c-met抑制剂的构效关系，设计合成了16个多芳类的新化合物，并对其进行了初步的活性筛选。主要研究工作及结果如下：

1、总结小分子c-met抑制剂的构效特点，设计合成了16个以二苯醚为母核的新化合物。以二苯醚结构为母核，在醚键的间位或者对位以亚甲基形式连接不同的五元环，期望含有该结构的化合物在抑制肿瘤细胞的同时将有镇痛作用。在醚键的另一苯环的对位上通过氨基成酰胺接不同的侧链，以求获得较好的活性。 trans-isomer订购 2、对合成的16个化合物进行c-met激酶抑制活性评价，在10μM浓度下，将所合成的化合物与阳性药物XL880进行了c-met抑制活性的对比，大部分化合物在10μM的浓度下对c-met都有一定的抑制作用。其中，抑制率在30%以上的有2个化合物：T05和T13；抑制率在20%-30%的有5个化合物：T08,

Rapamycin供应商 T11, T12, T14, T16；抑制率在10%-20%的有4个化合物：T01, T06, T10, T15；抑制率在0-10%的有5个化合物：T02, T03, T04,T07, T09。 3、对构效关系进行了初步分析。对于多芳类化合物，引入不同的酰基侧链有不同的抑制活性。含有脲基取代的化合物均有较好的抑制率，其活性优于含环丙基二酰胺取代的化合物。在含环丙基二酰胺取代的化合物中，苯环上吸电子基的引入有利于活性的提高，且引入的吸电子基的数目与其对PTK的抑制活性成正比。
C-met蛋白是肝细胞生长因子(HGF/SF)的受体,一种由位于染色体7q31区的C-met原癌基因编码的蛋白产物,具有酪氨酸激酶活性,参与细胞信号传导、细胞骨架重排的调控,是参与细胞增殖、分化与运动的重要因素。多项研究已证实在肿瘤组织中C-met的过表达与肿瘤的浸润、转移及不良预后密切相关。但在结直肠癌组织中C-met蛋白的表达水平与结直肠癌的临床分期,病理分级,生存期等关系的研究结果尚存争议,可能与以往国内缺少专门用于检测福尔马林固定标本中C-met表达水平的特异性单克隆抗体有关。本实验选用鼠抗人C-met单克隆抗体,特异性结合福尔马林处理过的C-met受体胞外区,检测了结直肠腺瘤及不同临床分期、病理分级的结直肠癌病灶中C-met蛋白的表达情况。结合临床病理特征进行综合分析,研究C-met蛋白与结直肠癌病理学特征相关性及预后的关系。目的：(1)研究C-met在结直肠癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的关系。 (2)分析探讨C-met表达改变与肿瘤发生、侵袭、转移的关系,为结直肠癌的预后判断及临床靶向治疗提供依据。(3)比较分析C-met单克隆抗体及国内常用的兔抗人C-met多克隆抗体在检测结直肠癌蜡块组织中C-met表达水平的差别。方法收集筛选78例不同临床分期及病理分级结直肠癌组织和6例结直肠腺瘤组织及详细临床及病理资料建立病例数据库。采用免疫组织化学染色方法检测结直肠癌组织中C-met表达水平,分析C-met的表达与结直肠癌临床病理特征的关系。进一步采用荧光免疫组化方法比较分析两种抗体的检测效能。结果(1)78例结直肠癌组织中C-met细胞浆染色结果：强阳性46例,弱阳性22例,阳性表达率分别为59%,28.2%；阴性10例(12.

采用实时荧光定量PCR法（Q-PCR）检测经病理学确诊的67例NSCLC患者新鲜肿瘤组织ERCC1和RRM1基因表达状态，患者均接受含铂双药方案化疗，收集并分析患者疗效数据，χ2检验分析ERCC1、RRM1基因表达状况与患者临床特征及其疗效的关系。 结果： 1.回顾性分析239例接受含铂双药方案化疗的晚期NSCLC的疗效发现：紫杉醇+铂组、吉西他滨+铂组、多西他赛+铂组3组患者ORR和DCR分别为42.5%、43.1%、35.2%（P=0.612）和84.1%、75.0%、74.1%（P=0.198），均无统计学差异；PFS分别为5.6、5.8、3.2个月，有统计学差异（P≤0.001）。

2.252例患者行EGFR基因突变状态检测，其中，110例存在突变，突变率为43.7%。EGFR基因突变率在女性（63.8%vs.29.3%男性）、不吸烟（59.8%vs.25.8%吸烟）、腺癌（50.3%vs.14.9%鳞癌）、IIIb-IV期（46.7%vs.26.3%Ia-IIIa期）患者中显著增高。110例存在EGFR基因突变的患者中，19-Del和21外显子L858R位点突变率分别为50.9%、42.7%，两者占到总突变的93.6%。47例患者行KRAS基因突变检测，KRAS基因突变率为4.3%。80例EGFR突变型患者接受EGFR-TKIs靶向治疗，ORR达72.5%，DCR达93.8%。亚组分析发现，一线与二线靶向治疗、19-Del与L858R位点突变、突变丰度强弱、不同靶向药物种类治疗的患者ORR均无统计学差异。 Dolutegravir购买 3.67例患者行ERCC1和RRM1基因表达状态检测。其中，ERCC1基因高、中高、中低、低表达患者分别为19.4%、34.3%、16.4%、29.9%。ERCC1基因表达状态与患者分期有关（P=0.014）。RRM1基因高、中高、中低、低表达患者分别为49.3%、26.9%、11.9%、11.9%。RRM1基因表达水平与性别有关（P=0.018）。分析患者ERCC1基因表达状态与接受含铂双药联合方案化疗疗效的关系发现：高、中高、中低、低表达组四组患者的ORR和DCR分别为46.2%、39.1%、45.5%、45.0%（P=0.971）和92.3%、87.0%、90.9%、75.0%（P=0.587），高+中高、低+中低表达组中位PFS分别为5.0和5.3月（P=0.507），均无统计学差异。因采用吉西他滨化疗的患者仅9例，故未能分析RRM1基因表达状态与吉西他滨疗效间的关系。

结论： 1.紫杉醇+铂、吉西他滨+铂、多西他赛+铂三组方案治疗晚期NSCLC均取得了较好疗效。三组方案在短期疗效上相似；在延缓肿瘤进展上，吉西他滨组和紫杉醇组较多西他赛组更有优势。 GDC0449 2.我国西南地区NSCLC患者中，女性、不吸烟、腺癌三种人群是EGFR突变的优势人群；EGFR基因突变以外显子19、21突变最常见，占93.6%；EGFR突变型患者接受EGFR-TKIs靶向治疗疗效好，EGFR突变是NSCLC患者使用EGFR-TKIs治疗获益的最重要疗效预测因子。 3. ERCC1基因目前尚不能作为一个理想的分子标志物预测铂类的疗效。
背景与目的： 目前，肺癌是癌症死亡的最主要原因。近些年来，在全世界范围内肺癌的发生率一直在增加。非小细胞肺癌大约占据肺癌总死亡人数的80%左右，约有70%以上的患者在明确诊断时大都是晚期，青年非小细胞肺癌（年龄≤40岁）在总发病人群中相对少见，来自欧洲及日本的研究调查数据显示，青年非小细胞肺癌发病率呈现出逐年上升的趋势，且其有与老年非小细胞肺癌不同的临床特点，青年非小细胞肺癌患者病情发展快，预后差。很多临床病理因素影响青年晚期非小细胞肺癌患者的预后。本文对2011年1月到2012年1月年在郑州大学第一附属医院和河南省肿瘤医院就诊的青年晚期非小细胞肺癌患者的患者临床资料，分析患者发病时的临床表现，明确患者的发病与这些因素的关系，以寻找影响患者预后的因素，提高对这些因素的重视。 许多 材料和方法 收集自2011年1月到2012年1月年在郑州大学第一附属医院及河南省肿瘤医院就诊的青年患者的病历，共计78例，其中59例来自郑州大学第一附院医院，19例来自河南省肿瘤医院。搜集并记录患者的临床资料包括：年龄，性别，吸烟，合并症，最初表现，PS评分，分期，淋巴结转移情况，诊断，治疗方式和反应，确诊时血红蛋白，血小板，C-反应蛋白，肝功能（谷丙转氨酶，谷草转氨酶）以及随访结果。用SPSSl7.0软件进行统计学分析。 结果： 1.随访截止时，全组78例青年晚期非小细胞肺癌患者生存时间为4～31个月，平均生存时间为14.9±6.1个月，中位生存时间为14.0个月，1年的生存率为57.7%，2年生存率为15.2%。单因素分析显示：性别，分期，BMI, PS评分,血红蛋白，血小板，CRP,治疗方式对生存期有影响（P＜0.05）。 2.青年晚期非小细胞肺癌患者的治疗方式患者生存时间有影响，对症支持治疗组的中位生存时间是6.8个月。单一治疗组的中位生存时间是14.0个月。综合治疗组的中位生存时间是19.0个月。

3.多因素COX比例风险回归分析表明：性别，分期，BMI,血红蛋白，C反应蛋白,治疗方式是影响青年晚期非小细胞肺癌患者生存的独立因素（P＜0.05）。 结论： 1.青年晚期非小细胞肺癌性别，分期，BMI,PS评分，血红蛋白，血小板，C反应蛋白,治疗方式是青年患者生存时间的影响因素。 2.总生存上，综合治疗的患者优于单一治疗组和支持治疗组。 3.青年晚期非小细胞肺癌患者的性别，分期，BMI，血红蛋白,C反应蛋白,治疗方式是影响青年晚期非小细胞肺癌患者生存的独立因素。女性、IIIb期，BMI≥25，血红蛋白≥110g/L，C反应蛋白＜5mg/L，积极采取综合治疗都是青年晚期非小细胞肺癌患者良好预后因素。
目的： 恶性淋巴瘤是头颈部继鳞状细胞癌和涎腺肿瘤后第三类最常见的肿瘤，其临床表现非常多样化，病理分型的也十分繁琐。对头颈颌面部恶性淋巴瘤临床资料和病理资料进行分类整理，分析其性别、年龄、首发临床表现、发病部位、病理类型、免疫组化检查等特点，进一步探讨临床病例特点与患者预后的关系，为本地区的头颈颌面部恶性淋巴瘤的预防、早期诊断、有效治疗及判断预后等提供一定的临床依据。 材料与方法： 收集2006年1月至2012年12月期间，在河南省军区医院病理科，经河南省抗癌协会病理会诊中心专家会诊，并经病理组织学检查和免疫组织化学检查确诊首发于头颈颌面部的恶性淋巴瘤初诊患者病例762例，并对其中的132例进行随访。所有符合纳入标准的患者均进行手术切除活检，并以最终的病理诊断结果为指标，均诊断为头颈颌面部恶性淋巴瘤。采用Epidata3.1对数据进行双录入，运用SPSS17.0软件的Kaplan-Meier法和Log rank检验进行生存分析，采用COX多因素回归分析来讨论淋巴瘤的生存相关影响因素。以α=0.

PKI-587是一种高效的双向PI3Kα, PI3Kγ和mTOR的抑制剂,其在包括乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肠癌及肝癌在内的多种肿瘤细胞株中都有强烈的抑制生长作用。由于在体外及移植瘤模型中PKI-587都发挥了强效的抗肿瘤作用,因此,为了更好的评估它的抗肿瘤活性,更多的Ⅰ期临床试验(NCT00940498)正在开展中。

在本研究中,我们在体内外水平来研究双向PI3K/mTOR抑制剂的抗肿瘤活性及对辐射敏感性的影响。为了更好的观察双向PI3K/mTOR抑制剂的效果及证实结果的可靠性,我们同时研究了两种双向PI3K/mTOR抑制剂：GSK2126458和PKI-587。我们认为联合双向PI3K/mTOR抑制剂和辐射可以增强鼻咽癌患者的临床疗效,并为今后鼻咽癌的靶向治疗的发展提供理论基础。 方法： 1.细胞增殖实验 细胞增殖实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌增殖的影响。将对数生长期的鼻咽癌细胞以每孔2×103个/100ul接种于96孔板中,贴壁24小时后在每孔中加入不同浓度的GSK2126458或PKI-587或培养基,继续培养72小时。然后,加入50ul的MTT溶液,在37℃的孵箱中培育2小时,移去MTT液,加入100ul的DMSO,在酶标仪下分别检测550nm和630nm处的吸光度。生长分数是以对照组为基准来计算的。每个实验重复至少三次,每次至少3个复孔。 2. Western blot实验 Western blot实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液来裂解鼻咽癌细胞,并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将约40ug的总蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,清洗4遍后,用5%小牛血白蛋白(BSA)在室温下封闭一小时后,加入一抗4℃孵育过夜。再清洗3遍后,加入特异性二抗,在室温下孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测蛋白条带。每个实验至少重复3次。 3.划痕实验 划痕实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移的影响。将细胞以80%-90%的密度种入6孔板中,贴壁24小时后,用0.2ml的枪头在汇合的单层细胞上轻轻滑过,用PBS洗干净划下的悬浮细胞后,加入含有双向PI3K/mTOR抑制剂的无血清培养基或单纯无血清培养基(对照组)培养24小时,并在不同的时间点(0h,12h,24h)拍照,测量划痕宽度。每组3个复孔,每孔随机选取9个含划痕的视野拍照测量,每个实验重复3次。 Selleckchem Necrostatin 1 4.细胞迁移和侵袭实验 细胞迁移和侵袭实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移和侵袭的影响。我们采用transwell小室来检测细胞的迁移和侵袭。Transwell小室的顶部和底部通过含有胶原质的8um的滤过膜分开。在迁移实验中,直接将培养基中含有0.1%BSA的1×105个肿瘤细胞种入小室内,而侵袭实验则需要加铺20-50μg/cm2的BD公司的基质胶在小室内,再种细胞,将含有GSK2126548或PKI-587的培养基加入小室下方。在37℃的孵箱中孵育24小时后,用棉签擦去留在残留在小室内没有迁移或侵袭的细胞。迁移和侵袭到小室下方的细胞则用甲醇固定、结晶紫染色。在200倍显微镜下随机取5个视野计数迁移和侵袭的细胞,每个实验重复3次。

Tacedinaline订单 5.克隆形成实验 克隆形成实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响。4种鼻咽癌细胞株按照不同浓度种入60mm的小皿中。在照射不同剂量射线(0,2,4,6,8Gy)前1小时加入GSK2126548或PKI-587,药物维持24小时后更换培养基。培养约14天后,细胞用甲醇固定,并用0.5%的结晶紫染色。计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率及存活分数。每个实验进行3次,每次3个复孔。运用GraphPad Prism5.0软件进行多靶单击曲线拟合,并绘制存活曲线。采用的多靶单击模型的公式为：SF=1-(1-e-D/D0)N。

6.免疫荧光实验 免疫荧光实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对双链DNA损伤的影响。我们用γ-H2AX抗体来检测DNA双链的断裂损伤。首先,将一定浓度的细胞种在玻片上37℃孵育24小时,然后加入GSK2126548(0.003μM)或PKI-587(0.03μM)孵育1小时后,进行4Gy射线照射,照射后24小时计数细胞内焦点数目。照完射线后24小时先用4%的多聚甲醛固定细胞,再用抗γ-H2AX的一抗4℃孵育过夜,洗掉一抗后,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗。在荧光显微镜下观察DNA损伤。每组5个复孔,每孔至少计数50个细胞,每个实验重复3次。 7.细胞周期实验和细胞凋亡实验 细胞周期及凋亡实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对细胞周期和凋亡的影响。将对数生长期的细胞种入6孔板中,加入GSK2126548或PKI-5871小时后,接受4Gy射线照射,照射后24小时收集细胞,用含有2%胎牛血清的冰PBS洗涤2遍后,加入70%的冰乙醇中-20℃过夜,沉淀、冲洗细胞后,在室温下加入PI染色液染色30分钟。凋亡实验则参照BD公司的annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书进行。使用FACS流式细胞仪的CellQuest软件进行数据分析,所有的实验重复至少3次。 selleck化学 8.动物实验 动物实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂对体内鼻咽癌增殖及辐射敏感性的影响。将5×106个鼻咽癌5-8F细胞制成单细胞悬液,皮下注射于5-7周雌性BALB/c裸鼠右腿外侧。当肿瘤体积达到200mm3时,将小鼠随机分入对照组和实验组(每组5只小鼠)。实验组接受300μg/kg GSK2126458,25mg/kg PKI-587,单纯辐射组,300μg/kg GSK2126458联合辐射或25mg/kg PKI-587联合辐射组。GSK2126458给药方法为：每周连续灌胃5天,1次／天。PKI-587给药方法为：尾静脉注射,1次/5天。辐射组采用直线加速器进行辐射,剂量率为5OOcGy/min,源皮距为100cm,小鼠每隔一天接受2Gy的照射,共4次。联合给药和辐射组则小鼠在给药后2小时接受辐射。每2天测量一次肿瘤大小。肿瘤大小计算公式为：肿瘤体积=(长×宽2)/2。接受处理后12天,当肿瘤体积达到3000mm3时,处死小鼠,取下肿瘤组织用来做Western bolt、免疫组化和TUNEL实验。 9.