0145μM较化合物WXY029(IC50=0.227μM)强,WXY032(IC50=0.22μM)较化合物WXY021(IC50=0.28μM)强,这表明含1H-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡嗪、3H-[1,2,3]三唑[4,3-b]哒嗪的螺[吲哚啉-3,4'-哌啶]-2-酮化合物较含3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶、嘌呤环的螺[吲哚啉-3,4'-哌啶]-2-酮化合物有作用强,含有1H-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡嗪的螺[吲哚啉-3,4’-哌啶]-2-酮化合物较含有3H-[1,2,3]三唑[4,3-b]哒嗪的螺[吲哚啉-3,4’-哌啶]-2-酮化合物作用强,螺[吲哚啉-3,4'-哌啶]-2-酮的6位取代较5为取代作用强。 4、对分子水平对c-Met酶有强抑制作用的吲哚唑、2,3,4,5-四氢-1H-吡啶[4,3-b]吲哚、螺[吲哚啉-3,4'-哌啶]-2-酮类化合物进行MKN45细胞中c-Met半抑制浓度(IC50)实验,实验结果表明,大部分化合物对细胞中c-Met有较强的抑制作用,部分化合物的ICso值在10μM以下。 确认细节 5、对五大类合成的36个化合物进行了分子对接研究,分子对接结果显示,所有化合物与c-Met位点均采取“U”型结合模式,具备Ⅰ型c-Met抑制剂的典型特征,喹啉环上的氮与Met1160主链羰基形成氢键,喹啉环C-8与Pro1158羰基上的氧形成一个非经典的C-H-O=C氢键。这种作用与其他ATP-竞争性酶作用相似,稠合环(1H-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡嗪环、3H-[1,2,3]三唑[4,3-b]哒嗪环、3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶、嘌呤、吲哚唑环)在Tyr1230和Met1211之间通过π-π堆积作用形成一个夹心结构,喹啉环和稠环之间的连接臂(亚甲基)刚好与Leu1157,Arg1086和Tyr1230或11109,Lys1110,A1a1226和Va11092组成的疏水口袋嵌合,该部分主要是影响稠合环的π-π堆积作用,在所有稠环中,以三唑吡嗪环效果最好,因为三唑哒嗪环作为一个缺电子母核在Tyr1230和Met1211之间通过π-π堆积作用形成一个夹心结构,三唑吡嗪环上的两个氮原子与Asp1222骨架上的NH形成两个氢键,因而与只能形成一个氢键的其它稠环相比其有较高的亲和力和较低的IC50值,而且与Asp1222间的氢键因其具有较低能量可以稳定该类化合物的构型。另外螺环上的哌啶环主要指向u型折叠构型的亲水表面,而该表面远离铰链区。因为在491个酪氨酸激酶中仅仅有c-Met,Axl和Mer三个激酶有两个氨基酸存在,来自Met1211和Tyr1230的疏水作用增加了该类化合物的选择性,螺环5位或六位取代的亲水稠环延伸到结合口袋,与WXY030相比,因螺环的张力存在使得WXY029不能与活性位点匹配,从而导致构型的改变以及增加N原子和Asn1167间的距离而不能形成氢键,因此WXY029的活性较WXY030低,同样的原因可以解释WXY031、WXY033、WXY035活性较WXY032、WXY034、

WXY036低。 综上所述,本课题主要针对c-Met设计了118个信化合物,合成出了36个新化合物,未见文献报道,此外还合成了17个关键中间体。所有目标化合物合成中都用到了Suzuki耦合反应,该反应在在DMF/H2O的混合溶剂中、Pd (PPh3)4催化下进行获得较高的收率,得到的的目标化合物以吲哚唑类、2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚类、螺[吲哚啉-3,4’-哌啶]-2-酮类化合物有较好的抗肿瘤活性,WXY030、WXY022和WXY023对c-Met生化半抑制浓度(ICso)达到了10nM,显示强的抗肿瘤活性,对分子水平抑制作用强的化合物进行细胞研究显示部分化合物对MKN45细胞中c-Met的抑制作用达到了10μM。分子对接研究证实和解释了这些化合物的活性。为开发具有临床应用价值的c-Met酪氨酸激酶抑制剂奠定基础。
抗肿瘤药物对机体正常细胞的细胞毒性及肿瘤细胞多药耐药性机制始终是抗肿瘤治疗的主要障碍。抗肿瘤靶向药物虽然有较低的细胞毒性和可选择性杀伤肿瘤细胞的作用,但多数靶向药物通常基于肿瘤细胞与正常细胞间差异性抗原研制,故在肿瘤细胞发生抗原漂移和抗原调变时常使抗肿瘤靶向药物的疗效减弱,甚至失去疗效。

R428 购买NVP-BKM120 在探索抗肿瘤治疗途径过程中,人们发现热疗法可在不伤害机体正常细胞的情况下选择性杀伤肿瘤细胞,而且还可通过热诱导作用使肿瘤细胞的免疫原性增强,从而有助于机体免疫系统对肿瘤细胞的识别,进而增强机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。然而,单纯依靠热疗方法进行抗肿瘤治疗,存在疗效低、治疗不彻底等缺点,因此热疗法通常与其它抗肿瘤治疗方法联合使用。 热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是高度保守的细胞蛋白质家族之一,肿瘤热疗、化疗等因素都可诱导产生热休克蛋白。HSPs可通过多肽结合阈与肿瘤细胞内不同的肿瘤相关抗原结合形成复合物并激活免疫系统。有研究表明,肿瘤细胞内HSPs水平显著高于正常组织细胞；在肿瘤细胞膜表面可检测到HSPs,而相同条件下正常细胞膜表面却检测不到HSPs。但是,肿瘤细胞经热诱导后细胞膜表面蛋白水平是否存在规律性变化以及能否用于抗肿瘤治疗鲜见报道。 为此,本研究首先考察经热诱导后人肝癌Hep G2细胞膜表面蛋白水平是否存在规律性变化。由于HSP70是肿瘤细胞膜表面的主要热诱导蛋白,故先采用流式细胞术等方法对热诱导后Hep G2细胞膜表面HSP70水平的动态变化情况进行研究。在此基础上,采用经热诱导的Hep G2细胞免疫BALB/c小鼠,通过免疫学和基因工程的方法构建单链抗体文库,然后利用核糖体展示和免疫亲和筛选方法,获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体,进而构建特异性单链抗体重组免疫毒素基因并对其表达的融合蛋白特异性、亲和性以及抗肿瘤活性进行检测。 研究显示Hep G2细胞膜表面HSP70水平在42℃热诱导后37℃恢复培养12h出现峰值,同时细胞膜表面可检测到HSP70的细胞百分数显著增加(由7.85%增加到15.11%)。采用核糖体展示技术成功筛选获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体克隆(scfv5669和scfv5670),进而成功构建单链抗体重组免疫毒素(scfv5669-seb).