首先,采用表面等离子共振技术评价了抗噻虫嗪单克隆抗体的识别性能;其次,以抗噻虫嗪杂交瘤细胞株为基因来源,经分子克隆获得了抗体可变区序列,由哺乳动物细胞HEK 293(F)体外表达成功获得了全长重组抗体;最后,基于正确的可变区序列,采用同源建模和分子对接手段,研究了抗体高亲和力特异结合噻虫嗪的分子识别机制。结果表明,抗噻虫嗪单克隆抗体可特异性识别噻虫嗪,且与其具有较高的结合亲和力(解离或平衡常数K_(D)=7.995×10~(-11) mol/L)。由HEK 293(F)体外表达的全长重组抗体,采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法进行评价,表明该重组全长抗体对噻虫嗪的IC_(50)值为0.41 μg/L,与其他新烟碱类农药的交叉反应率<0.04%,表现出与亲本单克隆抗体一致的性能,即具有高特异性、高灵敏度的识别活性。分子对接计算结果表明位于疏水Thiazovivin核磁结合口袋参与形成范德华力的8个氨基酸残基和参与形成氢键的Asn39 (L-CDR1)残基与抗体的选择性(特异性)相关,位于重链CDR区的两个氨基酸His35(H-CDR1)和Trp108(H-CDR3)残基决定了抗体对噻虫嗪的结合亲和力。该研究制备的重组全长抗体可代替传统单克隆抗体建立多种免疫检测方法,应用于环境样品和农产品中噻虫嗪的残留检测。解析的噻虫嗪抗通常原抗体分子识别机制,可为后续改造更高亲和力的抗体提供理论依据。
为了建立牛呼吸系统疾病主要病原-牛支原体的快速富集方法,试验采用PCR方法对牛支原体P48基因扩增,构建重组质粒pET32a(+)-P48。将重组质粒进行原核表达,并进行纯化。将纯化的牛支原体P48蛋白作为免疫原与弗氏佐剂混合乳化免疫家兔,获得抗牛支原体P48蛋白的高免血清,同时对高免血清进行纯化。将纯化后多克隆抗体与NHS磁性微球进行耦联,制备免疫磁珠。