观察芩丹胶囊含药血清对TGF-β1诱导的AF增殖、迁移、平滑肌肌动蛋白-α(alpha
smooth muscle actin,α-SM actin)、Ⅰ和Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白表达的改变,探讨芩丹胶囊对TGF-β1诱导的AF的生物活性的影响。 2.观察芩丹胶囊含药血清对TGF-β1诱导的AF Smad2、Smad3、Smad7、磷酸化Smad2 (phosphorylation-Smad2, p-Smad2)和磷酸化Smad3 (phosphorylation-Smad3, p-Smad3) mRNA和蛋白表达的影响,探讨芩丹胶囊对外膜成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路的作用。 方法 1.芩丹胶囊的制备及质量标准的研究：采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)和薄层层析法(Thin-layer chromatography, TLC),明确芩丹胶囊的有效成分。 2.成纤维细胞的复苏与传代：取出冻存管,快速解冻,用正常培养基悬浮细胞,离心后转移至培养瓶。待细胞长至90%融合时进行传代。 3.芩丹胶囊含药血清的制备：60只健康雄性Wistar大鼠随机分为3组：芩丹胶囊大剂量组(QC大剂量组)给予QC 750mg/(kg·d);芩丹胶囊小剂量组(QC小剂量组)给予QC 150mg/(kg·d);氯沙坦组给予氯沙坦30 Protein Tyrosine激酶抑制剂 mg/(kg-d)。各组均大鼠灌胃给药,最后一日禁食24h,末次给药后1h(氯沙坦组)和2h(芩丹胶囊组)后乙醚麻醉,腹主动脉取血,37℃水浴1 h,3000 rpm离心15min,取上清,过滤除菌,然后在-57℃条件下真空干燥,-20℃保存备用。 4.MTT比色法检测细胞增殖能力：制备细胞悬液,接种于96孔板,各组加入相应血清继续孵育48h,换用含20 ng/ml TGF-β1的培养基诱导24h,在刺激结束前4h加入MTT,弃上清,加入DMSO,振荡,比色。
5. Transwell法检测细胞迁移能力：细胞分组和处理同前,经过处理的细胞被消化,然后用DMEM制成细胞悬液,取0.6ml细胞悬液接种于上室,1.5ml含10%FCS的正常培养基加入下室。置入孵箱内培养6h,取出小室用湿棉签擦内侧的细胞,然后固定染色,计数。 6.实时定量PCR技术检测相关因子mRNA的表达：细胞处理同前,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA。观察芩丹胶囊和氯沙坦含药血清对TGF-β1诱导的Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。用2-△△Ct的方法对mRNA的表达进行相对定量分析。 7. Western-blot技术检测相关因子蛋白的表达：细胞分组和处理方法同前,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前胶原肽蛋白表达。 点击此处 寻找更多 8.统计学处理所有实验数据用x±s表示,数据资料均用SPSS 16.0进行统计处理。组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,设P<0.01)；各药物处理组增殖与TGF-β1刺激组相比,有非常显著性差异(P<0.05或P<0.01),其中以氯沙坦组减弱最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01),QC大剂量组和氯沙坦组较QC小剂量组有显著差异(P<0.01)；经药物处理以后,与TGF-β1刺激组相比,药物组细胞迁移数目均明显下降(P<0.05或P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；QC大剂量组、氯沙坦组与QC小剂量组比较有显著差异(P0.05)；与氯沙坦组相比,QC小剂量组Smad3
mRNA表达差异有显著性(P0.05)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Smad7 mRNA表达均显著提高(P<0.01)；QC大剂量组、氯沙坦组与QC小剂量组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01),小剂量组与氯沙坦组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,QC大剂量组和氯沙坦组Ⅰ型前胶原mRNA表达均显著下降(P0.05)。 (6)Ⅲ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Ⅲ型前胶原mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)；其中氯沙坦组下降最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；氯沙坦组与QC小剂量组比较有显著差异(P<0.01)。与TGF-β1刺激组相比,各药物组Smad2蛋白表达有所下降(P均<0.01)；氯沙坦组显著下降(P<0.01),且下降幅度大于QC大剂量组与QC小剂量组(P<0.05或P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组p-Smad2蛋白表达均显著下降(P<0.01)；QC大剂量组和氯沙坦组表达低于QC小剂量组(P<0.05或P<0.01)。与TGF-β1刺激组相比,氯沙坦组表达水平下降最明显(P<0.05),其次为QC大剂量组(P<0.