溃结灵含药血清对正常大鼠结肠上皮细胞增殖的影响 结肠上皮细胞在肠黏膜损伤修复中具有重要的作用,UC发病时,促进结肠上皮细胞的增殖、移行、分化,可加速受损黏膜的修复以及肠黏膜屏障功能的恢复。本实验采用溃结灵含药血清干预结肠上皮细胞,探讨溃结灵含药血清对结肠上皮细胞增殖的影响。 方法：采用血清药理学方法制备溃结灵含药血清；MTT法测定溃结灵含药血清干预大鼠结肠上皮细胞12、24、48h后细胞增殖情况。 结果：空白大鼠血清对大鼠结肠上皮细胞(CEC)生长无影响,溃结灵中剂量(5%含药血清)作用24h、48h均明显促进CEC增殖(p<0.05)；②24h时,各浓度TNF-α均明显抑制结肠上皮细胞增殖(p0.05)。 6.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞ITF、EGFmRNA表达的影响 ITF、EGF在胃肠道上皮保护和促进黏膜愈合方面发挥着重要的作用,与UC的修复愈合关系密切。本研究观察溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞EGF及ITFmRNA表达的影响,以进一步在离体细胞水平探讨溃结灵促进肠黏膜损伤修复的作用靶标。
方法：以50ng/mlTNF-α干预结肠上皮细胞6h,造成细胞损伤模型,采用荧光定量PCR (Real-Time PCR)法检测不同浓度溃结灵含药血清对此细胞损伤模型ITF及EGFmRNA的表达的影响。 结果：①模型组EGF、ITFmRNA表达较空白对照组减低；②溃结灵各剂量组(?)GFmRNA相对表达量与模型组相比,无统计学意义(p>0.05)；③溃结灵高(10%含药血清)、中剂量组(5%含药血清)ITFmRNA表达量明显高于模型组(p<0.05,p<0.05),溃结灵含药血清高剂量组TGF-α含量显著升高(p
目的： 吸烟明显增加动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)斑块的破裂和破裂后血管内血栓形成的危险性,然而相关分子机制尚不明确。微囊泡(Micro 寻找更多 vesciles, MVs)是细胞凋亡过程中产生的膜性囊状结构,近年研究证实动脉粥样斑块中存在大量单核巨噬细胞源性MVs,其致病力较母细胞更强、更持久,与AS斑块的进展密切相关。我们前期研究发现,TSE (Tobacco smoke extract, TSE)可增加单核细胞源性MVs的产生,该MVs携带组织因子,体外具有强大的促凝活性,解释了吸烟患者血液的高凝状态和斑块破裂后血栓形成的机制,但尚不能够解释吸烟患者AS斑块破裂的机制。因此,本研究旨在探讨TSE诱导巨噬细胞源性MVs是否具有蛋白水解酶活性,并探讨TSE诱导的蛋白水解酶活性MVs的分子性质和产生的分子信号通路机制。 所以 方法： 1.PMA诱导人THP-1单核细胞建立巨噬细胞模型和贴壁筛选法分离诱导外周血单核巨噬细胞； 2.酶谱法和荧光底物分解法测量TSE诱导MVs水解酶活性；
3.在37℃应用Pro-MMP2与分离MVs体外共孵育1h,然后用酶谱法检测TSE诱导MVs激活Pro-MMP2的活性； 4.免疫荧双染色共聚焦显微镜观察TSE诱导巨噬细胞膜性基质金属蛋白酶1(membrane type1metalloproteinase, MT1-MMP)又称MMP14和细胞凋亡早期标志物磷脂酰丝氨酸(PS)表达及分布； 5. Western Blot检测TSE诱导巨噬细胞MMP14蛋白表达变化、MAPKs信号通路的激活和MVs携带MMP14情况； 6.应用流式细胞技术测量TSE诱导总MVs和MMP14+MVs数量； 7.应用凋亡抑制剂(caspase inhibitor, CASPi),观察TSE诱导MMP14+MVs的产生和活性； 8.应用MAPKs信号通路p38/ERK/JNK特异性抑制剂干预细胞后,观察TSE诱导MVs产生和活性。
S3I-201 结果： 1.成功应用PMA建立THP-1巨噬细胞和贴壁筛选法分离诱导人外周血原代单核巨噬细胞； 2.TSE诱导MVs可动态水解人工合成荧光底物肽段1和降解凝胶中天然底物明胶蛋白和胶原蛋白； 3.TSE诱导MVs可激活人工重组Pro-MMP2的活性,级联放大效应发挥水解胶原蛋白的活性； 4.TSE诱导巨噬细胞呈浓度和时间依赖性增加MMP14的表达,共聚焦显微镜显示MMP14在巨噬细胞膜上呈结节性表达增加且与细胞膜的早期凋亡标志分子PS共定位,提示TSE诱导MVs携带MMP14； 5.流式分析显示TSE可诱导巨噬细胞源性总MVs和MMP14+MVs的产生； 6. CASPi可明显抑制TSE诱导巨噬细胞源性总MWs和MMP14+MVs的产生,并抑制MVs水解酶活性,不影响巨噬细胞表达MMP14； 7.TSE可激活MAPKs信号通路,使通路重要蛋白p38、ERK和JNK磷酸化,其中p38和JNK磷酸化与TSE诱导的巨噬细胞表达MMP14有关,与ERK的磷酸化无关； 8.应用p38和JNK特异性抑制剂可明显减少TSE诱导的MMP14+MVs的数量和活性。 结论： TSE干预巨噬细胞可明显增加蛋白水解酶活性MVs产生,与其携带的跨膜蛋白酶基质金属蛋白酶家族的MMP14有关,具有强大胶原和明胶蛋白酶的活性；TSE诱导的水解酶活性MVs产生与MAPKs信号通路中JNK和p38的磷酸化有关,与ERK磷酸化无关。我们的研究提示TSE诱导的蛋白水解酶活性MVs可能在AS斑块薄壁纤维帽形成中起着重要作用,是斑块破裂新的致病因子。
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病,主要表现为母猪严重的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病和生长受阻。PRRSV为单股正链RNA病毒,自20世纪80年代末爆发以来,PRRSV已经严重威胁到了全球养猪业的发展,并且造成了巨大的经济损失。自1995年我国报道发生该病以来,该病己成为困扰我国养猪生产中最重要的病毒性传染病之一。特别是2006年在我国出现的高致病性蓝耳病,导致全国各地大批生猪死亡,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV感染猪可以引起强烈的间质性肺炎,提示我们炎症反应在PRRSV感染和致病性方面扮演着十分重要的角色。然而,目前对这种毒株感染后引起宿主细胞的信号转导机制知之甚少。针对这种新的PRRSV,本文开展了对其诱导宿主细胞产生炎症反应信号转导机制的研究,为阐明PRRSV的致病机理以及其新型疫苗的研制提供理论依据。具体研究内容包括： 1.