正常对照组、吗啡组(2,5,10,20μM); 2正常对照组、吗啡组(6h,12h,24h);3.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)。置细胞培养箱孵育。

而且 2.细胞存活率的检测 使用MTT法检测细胞存活率。将细胞以1×104/孔的密度铺在96孔培养板内,使用不同浓度吗啡处理,然后将20μ1 MTT加入每个孔中,将培养板置于37℃孵育4小时。然后用ELISA读数仪在570nm波长下检测比色度。3.细胞凋亡的检测 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系以1×105/孔种植于铺有载玻片的12孔板中,置于细胞培养箱孵育,用吗啡及纳洛酮处理后,取出载玻片,将其用丙酮/甲醇(1：1)室温固定5分钟,然后按照TUNEL试剂盒指示进行操作检测细胞凋亡。 4. Western Blotting 使用Western Blot方法检测BV-2小胶质细胞经吗啡处理后cleaved caspase-3,caspase-3等蛋白水平的变化,用GAPDH作为实验内参。收集各组实验细胞后,使用RIPA Lysis Buffer裂解离心后用12%SDS-PAGE将样品蛋白电泳分离,然后转膜至硝酸纤维膜。将膜用5%脱脂奶粉室温封闭2小时,然后用一抗4℃孵育过夜后,再用二抗室温孵育1小时。最后暗室曝光并扫描记录结果。 5.细胞免疫荧光染色 使用细胞免疫荧光检测体外培养原代小胶质细胞经吗啡处理后cleaved caspase-3蛋白水平变化,用RCA-1作为小胶质细胞标志物。以1×105/孔种植于铺有载玻片的12孔板中,用吗啡及纳洛酮处理后,取出载玻片,将其用丙酮／甲醇(1：1)室温固定5分钟,将固定后的小胶质细胞用一抗室温孵育过夜,然后用二抗避光室温孵育2小时。最后用荧光倒置显微镜和Leica TCS SP2 Laser Scanning共聚焦显微镜观察实验结果。 6. RT-PCR 使用RT-PCR检测小胶质细胞经吗啡处理后CD11b、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平变化,用beta-Actin作为实验内参。收集各组实验细胞后,抽提RNA。以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。以cDNA为模板,用小鼠CD11b、TNFα、IL-1β和IL-6相应引物特异性扩增相应的基因。用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行半定量检测。 结果 1.吗啡通过阿片受体途径激活小胶质细胞

吗啡(2,5,10,20μM)处理后小胶质细胞激活标志物CD11b mRNA水平呈剂量和时间依赖性升高,较未处理组有显著差异。阿片类受体阻断剂纳洛酮可以阻断吗啡的作用。 2.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞凋亡MTT结果显示吗啡(2,5,10,20μM)处理后小胶质细胞存活率呈剂量依赖性明显下降。TUNEL染色显示吗啡处理(10μM)使小胶质细胞凋亡明显增加,较未处理组有显著差异。Western Blot结果显示吗啡(10μM)处理使BV-2小胶质细胞中caspase-3活化明显升高,而体外培养原代小胶质细胞cleaved caspase-3和小胶质细胞标志物RCA-1双抗体免疫荧光染色也得到一致的结果。并且纳洛酮可阻断吗啡引起的小胶质细胞凋亡及caspase-3激活。 3.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞细胞因子表达RT-PCR的方法检测了小胶质细胞经吗啡(10μM)处理后TNFαIL-1β和IL-6 mRNA的表达,发现小胶质细胞中上述三种细胞因子表达明显增加,较未处理组有显著差异。纳洛酮可阻断吗啡的作用。 结论 1.吗啡通过阿片受体途径激活并诱导小胶质细胞细胞因子的表达。 2.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞凋亡,caspase-3途径介导了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。 selleck screening library 第二部分GSK3β信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用研究 目的 使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系探讨GSK3β信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用及其具体机制。 方法 1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,5,10,20 u M)；2.正常对照组、吗啡组(6h,12h,24h) 3.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；4.正常对照组、吗啡组、SB216763组(10μM)、吗啡+SB216763组(SB216763提前1h加入)。置细胞培养箱孵育。 什么 2. Western Blotting 使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt、phosphor-GSK3β、cleaved

caspase-3、cleaved caspase-8、phosphor-p38、Bax、Bcl-2等蛋白水平变化。 3.细胞凋亡的检测 使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。 4. RT-PCR 使用RT-PCR检测小胶质细胞Bax和Bcl-2 mRNA水平变化。 结果 1.吗啡通过阿片受体途径使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3β蛋白水平降低 Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3p蛋白水平明显降低,且表现为时间和剂量依赖性,纳洛酮可阻断吗啡的作用。 2.抑制GSK3β增加吗啡诱导的小胶质细胞凋亡 TUNEL方法检测细胞凋亡,发现特异性GSK3β抑制剂SB216763预处理显著增加了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。Western Blot方法检测小胶质细胞cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平,发现SB216763预处理可以明显增加吗啡引起的caspase-3和caspase-8活化。 3.抑制GSK3β使吗啡处理引起的Bax/Bcl-2和phosphor-p38变化增加 Western Blot方法检测小胶质细胞Bax和Bcl-2蛋白水平变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax水平升高,Bcl-2水平降低。而SB216763预处理增加了吗啡引起的Bax/Bcl-2变化。RT-PCR方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2 mRNA表达变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低,而SB216763预处理增加了吗啡引起的Bax/Bcl-2 mRNA变化,与蛋白变化一致。Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-p38水平,发现吗啡处理使小胶质细胞phosphor-p38水平升高,纳洛酮可阻断吗啡的作用。而SB216763预处理可显著增加吗啡引起的phosphor-p38升高。 结论 1.吗啡通过阿片受体途径使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3β蛋白水平降低。 2.抑制GSK3β增加吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。 3.抑制GSK3β增加吗啡引起的Bax/Bcl-2水平变化。 4.