利用PC-PLC特异性抑制剂D609,研究PC-PLC在小胶质细胞活化中的作用 1)用MTT方法,检测D609的细胞毒性作用。 2)PC-PLC活性检测。 3)ELISA检测炎性细胞因子TNF-а、IL-1β的活性,来评价PC-PLC在小胶质细胞活化中作用 4)利用硝酸还原酶法,检测炎性介质NO含量变化。 4. PC-PLC在小胶质细胞活化中的作用机制 1)用Western blot方法,检测p38 MAPK、JNK、ERK蛋白磷酸化水平。 2)利用一氧化氮合酶(NOS)试剂盒,检测iNOS活性。
结果 1. BV2小胶质细胞培养通过倒置相差显微镜观察,BV2细胞成簇分布,胞体较小,胞浆浓缩,折光性强,清晰明亮。 2. LPS可激活小胶质细胞 2.1 LPS刺激BV2细胞形态学变化观察结果使用1μg/ml LPS处理BV2细胞24h,细胞形态出现明显变化,细胞胞体形态由正常的阿米巴样变为扁平状,胞体变大,较铺展,突起明显减少或者无突起,细胞多数悬浮。 2.2 LPS能够有效的诱导小胶质细胞活化本研究用ELISA法检测发现1μg/ml Alisertib体外 LPS刺激BV2细胞24h后,处理组细胞产生并释放大量的炎性因子TNF-α,与正常对照细胞升高约10倍,差异显著(P<0.01)。炎性因子IL-1β升高2倍,差异显著(P<0.01),而结构型cNOS活性变化不明显。用D609预处理阻断PC-PLC活性,能够明显抑制iNOS活性的升高(P
目的探讨SHR和2K1C两型高血压模型血管重构形式是否相同。检测MAPK家族成员ERK1/2、上游调解激酶MEK1/2以及下游底物CPLA2在两型高血压模型中主动脉和肾脏血管平滑肌细胞中的表达特点,对比研究ERK1/2信号通路在两型高血压模型血管平滑肌细胞增殖/凋亡中的作用及调节途径,进一步明确高血压血管平滑肌细胞变化的分子机制。 方法5周龄的雄性Wistar kyoto大鼠(WKY)36只,随机分为两肾一夹型高血压组(简称2K1C组,18只)和假手术正常血压对照组(简称SHAM组,12只)以及空白对照组(简称CON组,6只)。2K1C组大鼠用直径0.25mm的银夹部分夹闭左肾动脉,关闭切口。SHAM组仅分离出左肾动脉,不做其它处理,作为假手术对照组;空白对照组不做任何处理。术后各组大鼠分别观察至8周龄、16周龄和24周龄。SHR大鼠不做特殊处理,分别于8周龄(简称SHR8组,6只),16周龄(简称SHR16组,6只)和24周龄(简称SHR24组,6只)处死,迅速提取肾脏和胸主动脉,一半置于4%中性多聚甲醛溶液固定,行HE和免疫组化染色。另一半置于-80℃冰箱中冻存用于Western-blotting检测。目镜测微尺测量两型高血压大鼠各周龄主动脉和肾脏细小动脉血管中膜厚度/血管内径比值,免疫组织化学和Western Selleck NVP-BEZ235 blot方法对比研究两型高血压大鼠主动脉、肾脏细小动脉平滑肌细胞中p-ERK1/2、p-MEK1/2及CPLA2的表达。 结果1、血压变化:2K1C组大鼠造模一周后血压明显升高(P<0.01),随后稳定保持在较高水平(192.58±12.92mmHg)。SHR从8周龄组开始血压升高,随着周龄增加SHR组血压逐渐升高,18周龄后,SHR组血压明显高于2K1C组(P<0.01或P<0.01),SHR各周龄组肾小球损伤率均明显高于同周龄2K1C组(P<0.05或P<0.05)。5、CPLA2检测情况:SHR和2K1C主动脉、肾脏细小动脉平滑肌细胞CPLA2表达均明显高于同周龄假手术组(P<0.05或P<0.01)。相同周龄SHR和2K1C比较,2K1C8和16周龄组叶间动脉CPLA2表达明显高于相应SHR组(P<0.05),SHR8、16、24周龄组小叶间动脉CPLA2表达明显高于相应2K1C组(P<0.05或P
目的:研究α肾上腺素能受体激动对人外周血单核细胞TLR4信号通路及其中相关因子变化影响,探讨α肾上腺素能受体与TLR4的相互作用及其调控机制。
方法:采集健康青年人外周静脉血,进行离体实验。(一)观察不同剂量α受体激动剂去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)对人外周血单核细胞TLR4蛋白及mRNA、P38mRNA、NF-κBp65的影响及上清中炎症因子IL-6、IL-18的变化,选取10例健康青年人各抽取外周静脉血32ml,经EDTA抗凝后每份血均分为空白组、25μmol/L去甲肾上腺组、50μmol/L去甲肾上腺组、75μmol/L去甲肾上腺组,孵育18h后,用ELISA法测定血液离心后上清液中IL-6、IL-18的浓度,分离单核细胞后用流式细胞仪测定CD14+单核细胞TLR4阳性细胞百分率,提取RNA后采用RT-PCR测定TLR4mRNA及P38mRNA的表达,免疫组化法测定NF-κBp65蛋白的表达;(二)利用siRNA干扰技术使TLR4mRNA保持静默,观察用α受体激动剂NE刺激后相关因子浓度变化情况,选取10例健康人各抽取外周静脉血16ml,经EDTA抗凝后每份血均分为空白组、75μmol/L去甲肾上腺组、1nmol Scramble siRNA+0.24ml转染液组、1nmol TLR4 siRNA+0.24ml转染液组,转染18h后用ELISA法测定血液离心后上清液中IL-6、IL-18的浓度,分离单核细胞后爬片培养,免疫组化法测定NF-κBp65蛋白的表达。(三)利用不同阻滞剂分别阻断α受体、P38MAPK、PKA、PKC后,再用α受体激动剂NE刺激,观察TLR4蛋白表达量的变化,选取10例健康青年人各抽取外周静脉血6ml,经EDTA抗凝后每份血均分为25μmol/Lα受体阻滞剂酚妥拉明组、15μmol/L Sorafenib 花费 P38MAPK抑制剂SB 202190组、15μmol/L pKA抑制剂H89组、15μmol/L pKC抑制剂Go6983组,并设空白对照组、75μmol/L去甲肾上腺组,孵育0.5h后,再加入75μmol/LNE孵育18h后,采用流式细胞仪测定CD14+单核细胞TLR4阳性细胞百分率。 结果:1、应用不同浓度的α受体激动剂NE刺激人外周血单核细胞后,TLR4蛋白及mRNA、P38mRNA、核内NF-κBp65蛋白、上清中IL-6及IL-18的表达呈剂量依赖性升高:NE75组、NE50组分别与空白组及NE25组比较均明显升高,(p<0.05,p<0.01),NE75组与NE50组比较明显升高(p0.05);2、TLR4mRNA干扰后α受体激动剂NE刺激血液离心后上清液中IL-6及IL-18、单核细胞NF-κB P65蛋白的表达为:Si+NE75组均明显低于空白组、Sc+ NE75组及NE75组(P0.