1(+)一zrg，并稳 定转染到肝癌细胞系HepGZ。westem Blot和间接免疫荧光法等实 验表明人lrg基因己经成功转染。透射电镜的研究发现稳定过表 达人lrg基因的HepGZ细胞发生微绒毛的减少，说明过量表达的 人Lrg蛋白抑制了HepGZ细胞的生长;流式细胞仪检测表明稳定 过表达人lrg基因的HepGZ细胞产生细胞Gl期的阻滞，说明过量

因为 表达的人Lrg蛋白抑制了HepGZ细胞的增殖。 为深入研究人lrg基因的功能，课题组设计了人lrg基因的突 变引物，利用PCR法将亮氨酸拉链的第二个Leu突变为Ser(从 273匕p起cggtta突变为agatct)，构建了人lrg基因的定点突变 体。将带突变型人11.9的真核表达载体转染肝癌细胞系HePGZ， 经G418筛选得到稳定表达的细胞株。透射电镜显示实验组细胞出 现微绒毛减少、溶酶体增加，直至出现凋亡特征一细胞核固缩、边 移;同时流式细胞仪检测到凋亡峰。说明定点突变的人lrg基因 通过其编码的蛋白质对肝癌细胞系HePGZ产生促凋亡作用。 RN Ai是当今分子生物学领域最引人注目的技术之一。目前 RNAi技术在哺乳动物细胞中也得到了广泛的应用。本课题运用 RNAi技术对人lrg基因开展了初步研究。课题组针对人lrg基因 设计了RNA干涉核普酸片段，并克隆到5 hRNA表达载体pAVU6十27 中。将pAVU6+27一hlrg稳定转染入HepGZ一peDNA3.l价)一lrg细胞， RT一PCR检测结果表明，对人lrg实施RNA干涉的实验组细胞人lrg mRNA明显降解;western Blot表明RNA干涉后Lrg蛋白水平下 降;用兔抗人Lrg免疫血清进行的间接免疫荧光法显示，RNA干 涉后的细胞胞浆内的绿色荧光比对照组明显减弱。以上实验表明 RNA干涉是成功的。进一步的研究发现:从形态上讲，对人lrg 实施RNA干涉的实验组细胞多呈条索状生长，细胞突起增加，侵 第四军医大学博士李位论失 袭性增强:从细胞周期上讲，对人lrg实施RNA干涉的实验组 细胞Gl期明显缩短、GZ期延长，表明细胞的分裂前期增加，增 殖作用增强。 综上所述，课题组认为: 1稳定过表达的人Lrg可产生HePGZ细胞Gl期阻滞;RNA

干涉之后阻滞作用明显减弱。表明人Lrg可能是?
背景资料 急性胰腺炎是一种能够引起复杂的全身反应的一种急性炎症，其临床上总死亡率约10％左右，但重症病例的死亡率可达20－30％。大多数重症患者死亡原因多为多脏器功能衰竭（MOF），其中包括急性呼吸功能、肝功能和肾功能的衰竭。目前急性胰腺炎的病理机制尚未完全明了，但许多研究已证实中性粒细胞的过度活化在急性胰腺炎病理损害加重及并发多脏器功能衰竭乃至死亡中起了一个中心枢纽作用，在各种炎性介质、细胞因子的作用下中性粒细胞通过脱颗粒释放的氧自由基、弹力酶等毒性物质是胰腺局部及全身脏器损害的主要介质。 什么 目前已知，促炎性细胞因子如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、PAF，一些黏附分子如ICAM-1、?整合素和自由基等均参与了胰腺炎局部损害加重及伴发远隔脏器功能衰竭的病理过程；一些研究试图通过应用这些细胞因子的拮抗剂来治疗胰腺炎，但由于参与的细胞因子种类繁多，但用一种细胞因子拮抗剂很难取得良好效果。近年来这些因子被认为通过增加毛细血管通透性，促使中性粒细胞向炎症部位黏附、浸润并最终通过激活中性粒细胞来达到局部和全身病理损害的；因此，及时清除掉已激活的中性粒细胞在很大程度上能够改善重症胰腺炎的预后。在重症胰腺炎时，活化的中 性粒细胞自发凋亡延迟，这就意味着更多的粒细胞毒性物质被释放，从而导致炎症反应持续不断扩大。 中性粒细胞是寿命最短的、已分化的终末细胞，正常情况下自发走向凋亡。中性粒细胞的自发凋亡在急性炎症消退、防止出现继发组织损伤中起重要作用。许多证据显示，凋亡是使中性粒细胞失活的重要途径；在凋亡过程中，中性粒细胞丧失了黏附、吞噬、脱颗粒和释放炎性介质的能力，并很快被巨噬细胞所吞噬掉；这种胞膜完整状态下的粒细胞清除可避免像粒细胞坏死时大量细胞内毒性物质的释放。中性粒细胞凋亡后被巨噬细胞吞噬，吞噬细胞不但不释放促炎介质，反而释放抑制炎症反应的因子，如TGF-?,PGE2等。许多报道证实烧伤、重症感染、全身炎症反应综合征和再灌注损伤的病人均伴有外周血中性粒细胞凋亡延迟。由于中性粒细胞可通过多种途径损伤机体，粒细胞的凋亡延迟就意味着持续的炎症反应，并进一步可导致多脏器功能衰竭。 Antiinfection Compound Library溶解度 中性粒细胞可表达一系列Bcl-2家族蛋白，但由于人们应用不同的检测手段，这方面还有很多争议。目前已公认的是中性粒细胞不表达Bcl-2蛋白，但常规表达促凋亡蛋白Bax、Bak、Bid和Bad，这些促凋亡蛋白的半衰期相对较长，因此它们的持续表达可以解释为什么外周血中PMN生存期如此之短（6－10小时）；同时中性粒细胞也表达抗凋亡蛋白A1、Bcl-xl、Mcl-1，但抗凋亡蛋白表达时间很短暂（半衰期仅2－3小时）离体培养很快消失，因此，中性粒细胞凋亡是受半衰期短暂的抗凋亡蛋白A1、Bcl-xl、Mcl-1的调控。在没有新合成抗凋亡白A1、Bcl-xl、Mcl-1的情况下，半衰期长的促凋亡基因（主要是Bax）的活性占优势，导致粒细胞凋亡。然而，当生存信号存在时（如细胞因子），抗凋亡蛋白合成增加，粒细胞出现凋亡延迟。

目前关于急性胰腺炎时PMN凋亡方面的研究极少，胰腺炎时外周血中 性粒细胞凋亡延迟的具体信号传导方面更不清楚。尽管有报道发现了粒细胞在细胞因子如TNF-a、内毒素等单因素刺激下凋亡延迟的一些信号通路，但总的来说粒细胞凋亡延迟的具体通路还远未揭示。不同的细胞因子或刺激因素可通过不同激活不同的蛋白激酶、转录因子来发挥其促凋亡或抗凋亡的效应。由于重症胰腺炎时外周血中大量的细胞因子、活性氧、一氧化氮、炎性介质、各种蛋白酶等均被激活，单因素刺激下粒细胞凋亡延迟的信号途径并不能解释胰腺炎时粒细胞凋亡延迟的具体通路。近年来，细胞外信号调控的蛋白激酶（ERK）和细胞核转录因子NF-kB被认为是细胞生存的两大重要传导通路，而它们在胰腺炎粒细胞凋亡中的作用还未见报道，本实验建立重症胰腺炎动物模型，在体外培养的中性粒细胞中用ERK、NF－kB特异性阻滞剂来探讨ERK、NF－kB的激活在SAP时外周血中性粒细胞凋亡延迟中的作用。 实验方法 1、动物模型的建立：重症胰腺炎模型采用用微量泵向大鼠胆胰管内逆行注射3％的牛黄胆酸钠0.