25%胰蛋白酶-0.02%EDTA工作液消化分散细胞,进行传代或接种培养。 蛋白印迹(Western Blot)检测曲妥珠单抗对mTORC1和mTORC2信号通路的影响。将MDA-MB-453细胞接种于12孔板中,待细胞处于对数生长期后,在6组实验组中加入浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠单抗,设1组空白对照组及1组雷帕霉素对照组(雷帕霉素的浓度为0.1mg/ml),空白对照组加入等量生理盐水,孵育2h后提取蛋白,上样,电泳分离,转膜,室温封闭1h,加一抗4℃孵育过夜,加二抗室温孵育1h, 点击此处 ECL显色,曝光,洗片。 细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)检测曲妥珠单抗对MDA-MB-453细胞增殖的影响。将生长状态良好的MDA-MB-453细胞调整细胞浓度为2×104个/ml,接种于96孔板,每孔200μl,每组设5个平行孔。培养24h待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,分别为含生理盐水的培养基(空白对照组1组)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培养基(雷帕霉素对照组1组)和含有浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠单抗的培养基(实验组5组),继续培养3天后,按CCK8试剂盒说明书操作,最后用酶标仪测吸光度值(λ=450nm)。

平板克隆率试验检测在曲妥珠单抗的作用下乳腺癌细胞的克隆形成能力。将细胞接种于6孔板,每孔密度500个细胞,24h之后更换新鲜培养基,1组空白对照组、5组实验组培养基中分别加入生理盐水和浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠单抗。继续进行培养,每48h更换1次新鲜培养基,维持培养2周,2周后终止培养,弃去培养液,用PBS液冲洗2次,用甲醇室温固定15min,弃去甲醇,用0.15%结晶紫染液室温染色15min,用流水冲洗2次,室温晾干,拍照统计克隆形成数。 显微镜下观察乳腺癌细胞死亡情况。将生长状态良好的MDA-MB-453细胞调整细胞浓度为2×104个/ml,接种于24孔板,24h后待细胞融合密度达30%左右时,更换新鲜培养基,分别为含生理盐水的培养基(空白对照组1组)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培养基(雷帕霉素对照组1组)、含有浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠单抗的培养基(实验组4组)和含有0.1mg/ml雷帕霉素及浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠单抗的培养基(联合用药对照组4组),继续培养。每天同一时段对每一孔进行随机拍照,平均每孔三张照片,连续观察6天。

实验数据均用SPSS13.0统计软件处理。细胞增殖试验、克隆形成试验所有数据均用x±s表示。如果方差齐,采用方差分析(One-Way ANOVA)多组间比较,然后采用LSD法进行两两比较,如果方差不齐,采用Welch法多组间比较,然后采用Dunnet’s 这个 T3方法进行两两比较。检验水准a=0.05。 结果 Western Blot结果显示：雷帕霉素对照组的mTOR、S6、4EBP1磷酸化明显受抑制,实验组随曲妥珠单抗浓度的增大,mTOR、S6、4EBP1、Akt磷酸化水平越低,并且随着曲妥珠单抗的浓度增大,其对乳腺癌细胞mTOR信号通路的抑制效果较之雷帕霉素组更加明显。

http://www.selleckchem.cn/products/DAPT-GSI-IX.html CCK8试剂盒检测结果显示：空白对照组OD值为1.79±0.07,雷帕霉素对照组OD值为1.47±0.08,曲妥珠单抗实验组的OD值依浓度变化分别为1.37±0.11、1.28±0.03、1.03±0.09、0.68±0.09、0.37±0.03,对上述5个实验组和1个空白对照组进行方差齐性检验,6组数据的方差齐(P=0.083)；方差分析的结果显示,6组数据至少有2组的差异有统计学意义(F=221.863,P=0.000)。利用LSD法进行两两比较,与空白对照组相比,所有曲妥珠单抗实验组均可抑制MDA-MB-453细胞增殖,差异具有统计学意义(均为P=0.000)。根据细胞相对增殖率公式可得曲妥珠单抗实验组的细胞相对增殖率依浓度变化分别为(77±6.3)%、(71±1.5)%、(57±4.9)%、(38±5.1)%、(21±1.5)%,而雷帕霉素对照组的相对增殖率为(82±4.6)%。与空白对照组相比,雷帕霉素对照组可抑制MDA-MB-453细胞增殖,差异具有统计学意义(P=0.000)。 6组克隆形成数据显示：对照组与实验组的均值分别为每孔(519±32)、(283±23)、(140±18)、(110±12)、(83±10)和(19±6)个,克隆形成率分别为(100±6)%、(55±4)%、(27±3)%、(21±2)%、(16±2)%、(4±1)%。对上述6组克隆数据进行方差齐性检验,6组数据的方差齐(P=0.052)；方差分析的结果显示,6组数据至少有2组的差异有统计学意义(F=372.643,P=0.000)。利用LSD法进行两两比较,与空白对照组相比,所有曲妥珠单抗实验组P=0.000。 在显微镜下连续6天观察细胞死亡情况时发现,乳腺癌MDA-MB-453细胞为半悬浮圆形细胞,呈葡萄串样生长。使用药物6天后,不论是单药曲妥珠单抗组还是联合用药组,细胞数目都随曲妥珠单抗浓度增大而减少。但单用雷帕霉素从图片上看并不比曲妥珠单抗效果好,联合用药图片所见与曲妥珠单抗单药效果相差也不大,并且2.5mg/ml曲妥珠单抗+0.1mg/ml雷帕霉素药物组细胞数目却比2.