在养殖业中,牛角作为个体间争斗和伤人工具而成为养牛业的隐患之一。POLLED位点是目前发现控制牛(Bovidae)无角性状的主要位点,但在实际生产中,存在该位点的牛并不多见。为研制无角基因编辑牛,本研究利用CRISPR/Cas9技术,将POLLED位点P202ID基因型定点整合到有角蒙古牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞基因组中,建立P2PLX-4720浓度02ID基因型蒙古牛成纤维细胞系。首先以牛POLLED位点为靶点,设计合成4对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入到CRISPR/Cas9系统表达载体。Surveyor酶切结果显示,由sgRNA1～4构建的载体切割效率依次是24%、26%、55%和17%,其中p Cas-Guide-EF1α-GFLB100PsgRNA3活性最高。利用电转染法将活性最高的切割载体与含有P202ID序列的打靶载体共转染到蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过流式细胞仪分选阳性单细胞,进一步培养使其形成单克隆细胞;然后利用PCR及DNA测序技术,鉴定得到4株定点整合入细胞基因组的阳性单克隆细胞,可作为后续体细胞核移植的供体细胞。本研究可为培育无角体细胞克隆牛提供实验材LBH589料和技术支撑,为研究牛角的发生发育机制提供基础材料。
鱼类细胞培养技术是一种被广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、基因组学以及遗传学等方面研究的重要研究手段。斑石鲷(Oplegnathus punctatus)是优良的海水养殖鱼类,在水产养殖产业中备受青睐。本研究通过组织块法,以斑石鲷肝脏组织为材料,建立了斑石鲷肝脏细胞系(O. punctatus liver cell line, OPL)。